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自从细胞自噬（autophagy）于2016年荣登上诺奖舞台后，它作为细胞内清道夫的角色就广为人知，更是一跃成为科研者们心中的“香饽饽”。 其中，最为研究者津津乐道的就是，它在应激条件下（如饥饿、缺氧、辐射等）可快速切换成“吸尘器”模式，能尽职尽责地清除“废物”（受损、变性或衰老的大分子物质以及细胞器）以保证家里（细胞）的清洁。 显然，正常情况下，自噬是一种广泛存在真核细胞内的自我保护机制，能实现细胞对自身代谢和能量的更新，维持细胞稳态，在调节细胞生存和死亡的过程中也起着重要的作用。而一旦自噬功能紊乱，细胞也逐渐露出其狰狞面容，肿瘤、神经退行性疾病等便接踵而来。 而除此之外，自噬之所以备受青睐，还是有些其他特殊之处的。那么接下来自噬的其他技能点也将在24型中的第5型课程中得以详细的阐述。  自噬基本常识 一般哺乳动物的细胞自噬可以分为以下三种类型： 1）大自噬/宏自噬（macroautophagy）：细胞质中可溶性大分子物质、变性细胞器可被内质网、线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体；随后与溶酶体融合为自噬溶酶体，以内含的水解酶来降解相应底物，最终完成整个的自噬过程。 2）小自噬/微自噬（microautophagy）：该过程并不会形成自噬体，而是溶酶体膜自身发生内陷，直接包裹和吞噬细胞内待降解的底物，并在溶酶体内发生降解。 3）分子伴侣介导的自噬（CMA）：分子伴侣蛋白识别并结合带有特定氨基酸序列的可溶性蛋白质，再经溶酶体膜上的受体Lamp2a转运到溶酶体内被水解酶降解。此过程在降解蛋白时具有选择性，而这点是大自噬和小自噬不具备的。 图1：哺乳动物中，三种不同类型的自噬现象 自噬发生时，细胞胞质中内质网、线粒体的膜结构会形成具有双层膜杯状分隔膜的自噬前体；分隔膜不断延伸，并逐步包裹细胞垃圾形成密闭的自噬体囊泡；自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，降解其包裹的细胞成分，并循环再利用降解产物。 图2：细胞的自噬过程 自噬分子特征 细胞自噬在进化上具有高度保守性，其发生发展都受多种自噬相关基因的调控。目前，至少已鉴定出30多种自噬相关基因（ATG）。酵母、人和小鼠的自噬相关基因对应表见图3。 图3：酵母、人和小鼠体内，自噬相关基因的对应表 另外，细胞自噬还可细分为以下五个阶段： 1）自噬诱导阶段（induction）：主要通过ATG1复合物（包括ATG1/ULK1、ATG13和ATG17/FIP200）来介导的。此时，雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）活性被抑制，ATG13磷酸化水平降低，ATG13-ATG1-ATG17复合物形成并启动了自噬过程。 2）成核过程（vesicle nucleation）：Vps34（PI3K）-ATG6（Beclin-1）复合物（内含调节性蛋白激酶Vps15）可作用于膜泡的成核，介导前自噬体结构（PAS）形成；还可召集ATG12-ATG5和 ATG16多聚体以及LC3，并通过后两者促进吞噬泡的伸展扩张。 3）自噬体的延伸阶段（elongation）：主要依赖于两个类泛素化的系统——ATG12-ATG5的结合过程和LC3的修饰过程。两者之间可以相互作用、相互调节，且都需要泛素活化酶E1和E2的参与。 ATG12首先由ATG7活化，再通过ATG10转运并结合ATG5，然后结合ATG16生成ATG12-ATG5-ATG16的多体复合物。这个复合物定位于前自噬体结构的外膜表面，并参与前自噬体外膜的扩张。 LC3前体形成后被ATG4加工成胞浆可溶性的LC3-Ⅰ，再在ATG7和ATG3的作用下，共价连接磷脂酰乙醇胺(PE)形成脂溶性的LC3-PE（LC3-II），参与膜的延伸。LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标识物，也是一种重要的定位于自噬泡膜上的多信号传导调节蛋白。 4）自噬体的成熟阶段：自噬体通过微管骨架在转运必须内吞体分类复合物（ESCRT）和单体GTP酶（Rab S）作用下与溶酶体融合形成自噬溶酶体。参与其中的溶酶体相关蛋白还包括：LAMP1、LAMP2、UVRAG(紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因)。 5）自噬体的裂解阶段：自噬溶酶体膜的裂解，且内容物在溶酶体水解酶的作用下降解。降解过程中产生的氨基酸及部分蛋白可以为细胞提供营养、能量或循环利用。 这期间ATG22直接参与了部分氨基酸的运输，ATG12与ATG15可能参与了自噬溶酶体的裂解，ATG1和 ATG13还参与了溶酶体水解酶的转运。 图4：自噬过程的分子机制总结 细胞自噬形成过程的分子机制 由于mTORC1处于整个自噬过程的起点，所以细胞内很多通路能影响mTORC1的活性，并调控细胞的自噬过程。常见的通路有1）AMPK-mTORC1通路，2）class I PI3K/AKT/mTORC1通路，3）Ras/Raf/MEK/ERK通路。 3条通路对于mTORC1活性的调控机制 自噬与凋亡 自噬与凋亡作为细胞不同的死亡形式，是存在相互交互关系的，虽然两者间相互转换的具体作用机制还不清楚，却也为肿瘤的防治提供新的思路。 1）自噬和凋亡互相协同，共同促进细胞死亡。如自噬可作为凋亡的上游调节因子，直接调控细胞凋亡，从而影响细胞的死亡； 2）自噬可通过促进细胞存活而拮抗细胞的凋亡效应。如以去除受损的细胞器或变性的大分子物质，为饥饿的细胞提供生存所需要的营养和能量；或通过降解未折叠的蛋白来抑制内质网应激。 3）自噬有时虽然自身并没有导致细胞死亡，但却参与了细胞凋亡的过程。比如自噬参与了一些ATP依赖的凋亡过程。 自噬检测方法 1、电镜观察自噬体和溶酶体的超微结构 在超微结构下，自噬体是包裹有胞质组分的双层膜结构。通过电镜能从形态学的角度很好地鉴别自噬体，也能在早期阶段判断出溶酶体内的组分。 但它却很难分辨线粒体自噬（mitophagy）与核糖体自噬（ribophagy）间的差异，以及自噬溶酶体和内吞杂食泡的区别。 2、生化检测自噬体膜标志蛋白 ATG12-ATG5和LC3是自噬体膜上两种标志性蛋白，可通过western blot检测标志性蛋白的水平来判断机体的自噬现象。 但由于ATG12-ATG5仅存在于自噬早期阶段的双层膜上；且LC3在自噬过程中不断被切割和降解，所以很难单纯据此判断机体自噬是否被激活或抑制。
图5：LC3 的典型western 实验结果图 3、荧光显微镜检测LC3或GFP-LC3斑点的形成 自噬没有发生时，内源性LC3或绿色荧光蛋白GFP标记的LC3转染细胞后，绿色荧光在细胞溶质内表现为弥散状态，呈无规则状态分布；自噬发生时，细胞内产生大量的自噬体，而内源性LC3或外源性GFP-LC3在自噬体膜上表现为斑点状态，以此可判断机体的自噬状态。 但因该方法主观性比较强且实验过程中容易出现因为LC3或GFP-LC3过表达而形成的大片的荧光斑块，因而无法区分真正的自噬体或LC3的异常堆积。 4、生化检测自噬底物p62 p62作为一种自噬特异性底物，可与LC3相互作用渗入到自噬体并通过自噬溶酶体有效地降解。因此，p62的表达量的变化也可以用于监测自噬的变化。 但自噬并不是降解p62的唯一途径，单纯通过检测细胞p62蛋白表达水平判断机体自噬状态，也存在一定的缺陷。 5、检测长寿蛋白的批量降解 根据自噬机制主要负责降解长寿命蛋白的特性，先让细胞在含有同位素标记氨基酸(比如14C-或3H-缬氨酸或亮氨酸)的培养基中生长一段时间(数小时至数天)，细胞在此期间合成的蛋白质都将被同位素标记。 然后换成不含同位素的培养基，让一些被标记的短寿命蛋白通过蛋白酶体途径降解。在自噬诱导后，通过检测培养上清中释放的自噬性降解产物的放射性活度即可反映细胞自噬性降解的能力。 如果同时加入自噬抑制剂或者激活剂作为对照，更能特异性地反映自噬引起的蛋白质降解。
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