|
编译：吴悠，编辑：Tracy、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 细胞自噬是进化上高度保守的，针对胞内成分再循环的溶酶体降解过程。然而在疾病过程中，这一内在的自我保护过程往往会功能失调紊乱。细胞自噬帮助清除受损的细胞器（organelle）、蛋白聚集体（protein aggregate）和生物大分子（macromolecule），实现细胞物质的循环与再利用，以维持细胞稳态。在溶酶体中，蛋白相互作用在自噬小体生成、底物装载、运输与融合、跨膜转运和降解过程中发挥着核心作用。基于蛋白质组学的蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）研究极大的帮助解析了自噬的分子调控机制。在这篇综述中，作者详述了蛋白互作亲和力和质谱检测在揭示自噬分子机制研究中的重要性。作者并对亲和纯化方法（affinity purification approach）和质谱偶联的邻近标记技术（proximitylabeling coupled to mass spectrometry，AP-MS）的作用展开了讨论。 论文ID 内容 1.简介 大多数蛋白质通过两种途径降解：泛素蛋白酶体系统（ubiquitinproteasome system）和细胞自噬（autophagy）。自噬作用是一个分解代谢过程，主要是细胞通过溶酶体代谢机制降解细胞内组分的过程。因此，细胞自噬形成了组成型和刺激依赖型的溶酶体降解途径，以维持细胞稳态。生物大分子，蛋白质聚集体和细胞器被降解并循环利用，以实现细胞的能量需求，并为合成代谢过程补充基本的构建单元。细胞自噬通常以保护细胞的方式起作用，并且其失调与多种疾病如神经退行性疾病，癌症和代谢综合征有关。真核细胞生物中主要存在三种类型的自噬：巨自噬（macroautophagy），微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。微自噬是在溶酶体的表面通过溶酶体膜的内陷、突出和分隔来主动、直接吞噬细胞质成分。分子伴侣蛋白介导的自噬是由细胞质分子伴侣Hsc73识别底物蛋白质分子的特定氨基酸序列（如KFERQ序列），并与之结合，随后该复合物与溶酶体膜蛋白LAMP2A结合，底物去折叠并由溶酶体分子伴侣HSPA8/HSC70（heat shock protein family A [Hsp70] member 8）介导其在溶酶体上发生转位进入溶酶体被分解。巨自噬（下文称为自噬）是一种细胞内降解途径，始于称为自噬体（autophagosome）的双膜囊泡的形成，该囊泡包裹了靶向溶酶体降解的细胞质。自噬体的生物发生包括不同的层次阶段，首先是形成称为吞噬细胞的杯状膜（phagophore），然后是吞噬体的延伸，成熟，封闭，与内体（endosome）的融合，最后是与溶酶体的融合，从而导致自溶体（autolysosome）的形成。 经过多年的研究，酵母成为细胞自噬分子机制研究最为充分的模式生物。现已报道了超过40个自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）参与细胞自噬调控，且大部分在酵母和哺乳动物之间存在保守性。细胞自噬的核心途径受六个保守的蛋白质复合物调控：（1）ULK1（unc-51 likeautophagy activating kinase 1）-ULK2复合物：自噬诱导阶段（autophagy initiation）；（2）ATG9复合物：为自噬体的产生提供膜材料；（3）phosphatidylinositol 3-kinase （PtdIns3K）复合物：产生PtdIns-3-phosphate （PtdIns3P）；（4）ATG2-WIPI复合物：促进吞噬泡的伸展扩张；（5）ATG12复合物；（6）Atg8家族泛素偶联系统复合物。下文作者详细地讨论了这些复合物的作用（图1）。 2.调控细胞自噬的蛋白复合物 自噬的启动由两种激酶复合物执行：ULK1复合物（酵母Atg1在哺乳动物细胞中的同系物）和PtdIns3K复合物。ULK1（或其同系物ULK2）是一种Ser/Thr激酶，可将自身及其复合物成员ATG13，ATG101和RB1CC1/FIP200磷酸化。它们一起形成有活性的四聚体自噬起始复合物。内质网（endoplasmic reticulum，ER）膜蛋白VAPA（VAMP associated protein A）-VAPB通过和ULK1和RB1CC1的FFAT基序相互作用而募集该起始复合物，从而在内质网膜上形成了活跃的杯状膜起始位点。此外，VAP蛋白与含有WD重复序列的WIPI2蛋白相互作用，WIPI2则能够增强内质网-杯状膜的接触。ATG9是一种跨膜蛋白，主要位于反式高尔基体（trans-Golgi network）和内体。由于它共定位到杯状膜，因此推测ATG9可以为杯状膜的产生和扩增提供脂质来源。包含ATG9的囊泡与包含ATG16L1的囊泡融合，逐步促进自噬体的生成（图1）。 有两种PtdIns3K复合体存在。由脂质激酶PIK3C3/VPS34，衔接蛋白PIK3R4/VPS15，ATG14，稳定亚基BECN1/Beclin-1和辅助亚基NRBF2组成的I类PtdIns3K复合物促进自噬。在II类PtdIns3K复合物中，UVRAG替代了ATG14和NRBF2，该复合体在自噬的后期阶段发挥功能。ULK1通过磷酸化以下蛋白来帮助募集I类PtdIns3K复合物到活性起始位点：（a）AMBRA1蛋白的Ser465和Ser635，（b）PIK3C3蛋白的Ser249，（c）BECN1蛋白的Ser15（人）/Ser14（鼠），（d）ATG14蛋白的Ser29。PtdIns3K复合体在杯状膜位点增加了PtdIns3P（PtdIns-3-phosphate）的产生，导致PtdIns3P结合蛋白ZFYVE1/DFCP1的积累，继而形成omegasome。这些omegasome结构为参与自噬体生物发生的WIPI1和WIPI2蛋白提供了互作平台。WDR45B/WIPI3和WDR45/WIPI4积极影响产生PtdIns3P的上游和下游信号传递事件，从而控制自噬体的大小。另外，酵母脂质转移蛋白Atg2（ATG2A和ATG2B）的人类同源物与WIPI的相互作用。ATG2参与维持膜系带或内质网与吞噬细胞之间的接触位点，后期还有助于自噬膜的封闭（图1）。 类泛素修饰子（Ubiquitin-likemodifiers，UBLs）在自噬体货物募集和成熟中起重要作用。ATG12和Atg8家族同源物是典型的类泛素修饰子。ATG7，是一种E1样的酶，它激活ATG12的C端甘氨酸并将其交给ATG10（一种E2样酶）。ATG10将ATG12转移至其靶标ATG5，后者再与ATG16L1结合形成ATG12–ATG5-ATG16L1三聚体复合物。Atg8家族同源物分为两个亚家族：由MAP1LC3A，LC3B，LC3B2和LC3C组成的LC3家族和由GABARAP，GABARAPL1和GABARAPL2组成的GABARAP家族（以下统称为LC3蛋白）。LC3蛋白通过与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）结合而锚固在膜中。首先，ATG4B蛋白酶在C末端的切割暴露了一个末端甘氨酸残基，并激活LC3（LC3-I）以与ATG7结合。具有E2连接酶活性ATG3蛋白和ATG12–ATG5-ATG16L1复合物将LC3-I（胞质）转移至PE（LC3-II）。LC3蛋白主要参与降解底物的选择性捕获，但是，LC3蛋白也有助于新生自噬体的成熟和封闭。通常，自噬体与内体融合形成自噬内涵体（amphisome），然后它们最终与溶酶体融合形成自溶体以降解其内含物。成熟的自噬体与溶酶体的融合是通过RAB和SNARE蛋白以及膜束缚复合体（如RAB7A，STX17，SNAP29，VAMP8和HOPS复合体）的相互作用而协同进行。 合成代谢和分解代谢之间的平衡对于细胞存活至关重要。由激酶MTOR（mechanistic target of rapamycin kinase）和调控亚基MLST8和RPTOR组成的Ser/Thr激酶复合体MTORC1正调控细胞的生长代谢。由MTOR，RICTOR和MLST8组成的MTORC2被认为正向调节细胞增殖。MTORC1通过抑制ULK1的Ser637和Ser757和ATG13的Ser258的磷酸化阻止了它们形成有活性的自噬起始复合物从而抑制分解代谢途径。营养剥夺或雷帕霉素处理可抑制MTORC1活性而激活自噬。在饥饿条件下，ULK1蛋白去磷酸修饰是由包括催化亚基PPP2CA，支架亚基PPP2R1B/PRL65和调节亚基PPP2R2A/B55 alpha组成的PP2A蛋白磷酸酶进行。此外，能量需求会激活AMPK（AMP-activated protein kinase）蛋白。AMPK通过使ULK1的Ser317，Ser659和Ser777和ATG13的Ser224磷酸化来激活ULK1复合物，活性状态的ULK1还催化包括Thr180，Ser1042和Thr1046等位点的自磷酸化。 自噬中各类动态事件受到蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）和翻译后修饰（post-translational modification，PTM）的高度调控。许多技术被用来研究体外和体内的蛋白质相互作用。相互作用的强度（强/持久或弱/瞬时）决定了特定方法的效率。为了获得全局的无偏见的PPI，基于质谱的蛋白质组学方法（mass spectrometry-based proteomic approach）受到了广泛关注。这些新方法允许检测强相互作用和弱相互作用，从而支持互作层次网络的构建。共免疫沉淀如串联亲和纯化（tandem affinity purification，TAP）可检测互作强度大的相互作用；亲和纯化（affinity purification，AP），邻近标记（proximity labeling，PL）或其他生物化学偶联的质谱检测则广泛用于捕获弱相互作用。在以下章节中，作者总结了基于质谱分析识别PPI的不同方法，并重点介绍这些方法在研究自噬机制调节中的应用。 图1 自噬体的生成和成熟过程 营养丰富的条件下，MTORC1通过抑制ULK1和ATG13的磷酸化来抑制自噬。而在压力条件下，活性四聚体ULK1起始复合物的形成激活自噬，促进自噬核的形成。PtdIns3K复合体I催化PtdIns3Ps的产生，而PtdIns3Ps有助于吞噬核的形成和omegasome体的形成。继而PtdIns3P结合蛋白，像ZFYVE1/DFCP1和WIPIs等修饰omegasome体。WIPI2与ATG16L1的相互作用介导了ATG12-ATG5-ATG16L1复合物的募集，将LC3-I与PE缀合，导致吞噬体扩展和成熟。此外，WIPI募集ATG9，ATG2A/B扩大吞噬膜。双膜自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体，其内容物被溶酶体水解酶降解。 3.蛋白相互作用和调控 动态PPI几乎参与了所有的生物过程，例如代谢，DNA复制，蛋白质合成以及自噬。相互作用的范围可以从简单的二元相互作用到复杂的多聚体相互作用。因此，了解这些相互作用对于揭示分子功能和疾病相关机制以设计有效的治疗方法非常关键。根据互作稳定性，PPI可以分为专性（obligate interaction）和非转性（non-obligate interaction）。根据互作结合亲和力，PPI可以分类为永久相互作用（permanent interaction）和瞬时相互作用（transientinteraction）。然而，PPI通常不会处于静态，反之，这是一个高度动态变化的过程。特定蛋白质还可以与不同的蛋白质相互作用，并形成不同的复合物，因此专性和非专性互作取决于特定的生理状况。根据亲和力强弱，瞬时相互作用可以进一步分为强和弱瞬时相互作用。此外，蛋白质复合物根据组成成分分为同源寡聚物复合体（homo-oligomeric complex）和异源寡聚物复合体（hetero-oligomericcomplex）。同源寡聚物复合体通常形成高度稳定的永久对称结构。它们还可以形成支架以利于其他大分子的相互作用。例如，酵母Atg7是一种E1样酶，可形成具有功能活性的同源二聚体复合物（Kd = 1 nM）。TUBA（tubulin alpha）和TUBB（tubulinbeta）形成异二聚体（Kd≈84 nM [54–123 nM]），该聚合体形成动态微管有助于自噬体的形成，运动以及与溶酶体的融合。CASTOR1（cytosolic arginine sensor of MTORC1）蛋白形成稳定的同源二聚体并通过与精氨酸结合而充当氨基酸传感器（图2）。 瞬时相互作用复合物的结合与解离则取决于生理条件。异源寡聚物复合体通常形成稳定性不同的瞬时复合物。与弱瞬时相互作用比，强瞬时相互作用具有更高的亲和力和更长的寿命。例如，ATG3激活ATG12形成一个强的，瞬时的复合物（Kd = 50 nM）。BECN1蛋白在营养丰富的条件下没有活性；但是在自噬激活后，BECN1单体可与ATG14（Kd= 3.2 μM）相互作用，形成有活性的PtdIns3K III类复合物。瞬时相互作用处在动态破坏和形成的过程中，并且难以通过生化/分析方法捕获。例如，钙黏着蛋白（cadherin）是粘附蛋白，其介导细胞与细胞之间的通讯。不同钙粘着蛋白在不同细胞类型中的表达有助于发育过程中各个细胞的空间定位并维持其3-D结构。为了维持特定的细胞间通讯，CDH1/E-钙粘着蛋白形成弱的同源二聚体（Kd = 160 μM）。CDH1还与CDH2/N-钙粘着蛋白形成相互作用更强的异源寡聚体，介导不同细胞类型的接触。自噬通过调节CDH1的丰度来确保最佳的细胞生长。SNX（sorting nexins）是一类对内体分选重要的外周膜蛋白，可以通过其Bin/Amphiphysin/Rvs（BAR）结构域寡聚化，从而实现囊泡至肾小管膜重塑。在某些生理条件下SNX4可以与SNX7形成异源寡聚复合物介导自噬体的组装和成熟。总体而言，以上示例突出了蛋白互作中不同的亲和力对于自噬的重要性（图2）。 图2 根据稳定性和亲和性的PPI分类 PPI可以根据亲和力分为两大类 4.基于质谱的蛋白质组学研究蛋白质-蛋白质相互作用 由于蛋白质-蛋白质相互作用的重要性，现开发了许多细胞生物学和生化方法来研究PPI，包括亲和纯化（affinity purification），尺寸排阻色谱（size-exclusionchromatography），蛋白质阵列（protein array），酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay）和生物物理方法，例如等温量热法（isothermal calorimetry），微尺度热泳（microscalethermophoresis）和表面等离振子共振（surface plasmon resonance）。基于质谱的方法包括：AP-MS（Affinity purification-massspectrometry），XL-MS（chemicalcross-linking MS），CoFrac-MS（co-fractionationcoupled to MS）和PL-MS（Proximitylabeling-mass spectrometry）；体内方法包括酵母双杂交或BIFC（bimolecular fluorescence complementation），FRET（Förster resonance energy transfer），BRET（bioluminescence resonance energy transfer）和邻近连接测定（proximity ligation assay）等。 基于质谱的蛋白质组学研究已广泛用于了解生物学途径中的生物机制。质谱仪器，液相色谱，样品制备方法，高通量分析和生物信息学等方面的技术进步大大提高了基于质谱的方法的使用。蛋白质组学研究的最终目标是全面表征蛋白质组，蛋白质表达水平，翻译后修饰，并建立功能相关的蛋白质网络。根据蛋白质鉴定和表征的特点，蛋白质组学被区分为top-down和bottom-up蛋白质组学。在top-down蛋白质组学中，完整的蛋白质被离子化，碎片化并被高分辨率质谱仪所检测。这种方法提供了包括翻译后修饰等在内的蛋白质完整表征。在bottom-up蛋白质组学中，完整的蛋白质被分解成肽段后被质谱仪所检测，该程序易于自动化，并且通常有助于鉴定大量蛋白质，需要复杂的前端生化方法来制备分析的样品。 质谱数据采集存在不同的策略：数据依赖性采集（data-dependent acquisition，DDA），数据不依赖性采集（data-independent acquisition，DIA），无偏见发现方法（both unbiased discovery method）和定向/靶向蛋白质组学方法（directed/targeted proteomics approach）。这些策略在蛋白质鉴定的深度或广度上有所不同。通常样品分离和制备，质谱数据采集，数据分析和统计分析的每个步骤都可以使用不同的工具或方法。在选择具体工具方法前，各策略的优缺点需和灵敏度，特异性，可重复性，准确性和检测动态范围上进行权衡。考虑到质谱在生物学问题中的广泛适用性，选择正确的工具方法组合对于回答自噬复杂的生化调控机制非常重要。 5.定量蛋白质组学 由于质谱仪记录的信号强度取决于各个生物分子的电离特性，因此质谱并不是真正的定量分析方法。因此，开发出了定量蛋白质组学策略，可以对样品进行系统的定量分析，从而揭示被测蛋白质组之间的变化。定量信息是表征蛋白质和翻译后修饰的关键。定量可以通过两种方式进行，绝对的或相对的。通过将生物分子的信号强度与已知量的合成/纯化标准品的信号进行比较，可以实现绝对定量。相对定量则通过比较不同样品之间的离子强度。蛋白质或多肽的定量可以通过无标记（label-free）或通过稳定同位素标记策略进行。标记方法还可以通过添加质量不同但不会干扰电离特性的标签实现。标签可以在蛋白质或肽水平通过酶，化学或代谢方式添加。 通常使用13C和15N同位素标记的策略来实现代谢标记。最常用的方法SILAC（stable isotope labeling by amino acidsin cell culture）：是在细胞培养中使用同位素标记的必需氨基酸赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）。SILAC主要用于哺乳动物细胞培养研究，代谢标记允许在生化操作之前混合细胞，从而提高了定量准确性。在bottom-up的蛋白质组学实验中，酶可以在质谱样品制备过程中进行标记。例如，使用18O标记的水可以将18O掺入到蛋白水解消化产生的新C末端。反应性N-末端和氨基酸侧链还可以用来进行化学修饰。由报告基团、平衡基团和反应基团组成的Isobaric mass标签可与氨基酸N端及侧链的伯胺基团发生反应，如iTRAQ（Isobaric Tag for Relative AbsoluteQuantitation）和TMT（Tandem MassTag）技术。这些标签具有相似的化学结构，唯有13C和15N同位素的位置，数量以及组合的不同。由于采用了新的生物信息学方法，基于DDA或DIA的无标记方法也发展成为广泛使用且便宜的方法。无标记和有标记方法在样品类型，成本效益，定量准确性，灵敏度和蛋白质组覆盖率上各有优缺点。 6.亲和纯化质谱研究蛋白质相互作用 AP-MS是鉴定PPI的广泛使用的方法。该方法的原理是分离目标蛋白（称为诱饵蛋白）并通过质谱鉴定/定量其相互作用蛋白。对于亲和纯化，通常使用识别内源蛋白的抗体或与标签识别结构结合的抗体。亲和标签或抗体则被共价固体基质（如琼脂糖珠）所捕获，通常，抗体与固体基质偶联并用于捕获标记的或内源的诱饵蛋白。两种最常见的亲和纯化方法：（i）基于抗体的免疫沉淀内源蛋白和（ii）亲和标签。在基于抗体的免疫沉淀中，内源性蛋白及其互作组分可以被富集。例如，通过AP-MS方法发现了肿瘤抑制蛋白CDKN2A/ARF诱导自噬。在自噬条件下，CDKN2A在线粒体中与BCL2L1/Bcl-XL相互作用，干扰BCL2L1-BECN1相互作用，并使BECN1与PIK3C3复合物结合促进自噬体的产生。免疫沉淀内源蛋白的方法可以找到互作组分的信息，但该方法存在如下缺点：首先，抗体可以结合不同的诱饵蛋白亚型或剪接变体。其次，由于抗体和相互作用的蛋白质之间的竞争，蛋白质的相互作用可能被破坏。第三，测试和选择正确的高质量抗体进行免疫沉淀可能会花费巨大。最后，对照抗体可能不会代表相同的背景结合物（图3）。 亲和表位标签被开发来研究蛋白相互作用。这些亲和标签可以分类为基于蛋白质或肽段的标签。肽段标签包括：HA（hemagglutinin），FLAG，MYC/c-myc，6x/8x His，2xSBP（streptavidin-binding peptide）和CBP（calmodulin-binding peptide）等。蛋白标签包括：GFP（green fluorescent protein），MBP（maltose binding protein）和GST（glutathione-S-transferase）。除了单个标签，还存在由蛋白质结构域/肽，切割位点和纯化位点组成的TAP双重标签（图3）。 图3 亲和纯化质谱（AP-MS）示意图 （A）内源蛋白的亲和纯化是使用与beads偶联的内源蛋白特异性抗体来鉴定相互作用蛋白。（B）单标签蛋白的亲和纯化是使用标签特异性抗体进行亲和纯化来鉴定相互作用蛋白。（C）双标签蛋白的亲和纯化是使用双重抗体进行亲和纯化来鉴定相互作用蛋白。TAP标签由两个用于纯化的生化标签组成。在经典的TAP中，第一个标签是蛋白A的ZZ结构域，其后是TEV蛋白酶切割位点和第二个标签，该方法涉及两个连续的纯化步骤。 许多研究使用上述标签来揭示调节自噬体生物发生中的PPI。利用HEK293T细胞表达65个HA标签的蛋白进行AP-MS分析确定了2553个潜在的相互作用因子，揭示了一个涉及哺乳动物自噬的相互作用网络（见表一）。这些相互作用表明蛋白质激酶，PtdIns3P结合蛋白，脂质转运蛋白，脂质激酶和蛋白质泛素化机制共同参与自噬。例如，ULK1和ULK2与AMPK的相互作用表明自噬与能量传感存在交叉。AP-MS分析携带GST标签的LC3变体，发现LC3B与FYCO1相互作用。FYCO1还与RAB7A和PtdIns3P结合并促进自噬小泡的微管依赖性转运。AP-MS分析携带GST标签的GABARAPL1蛋白，发现其与HSP90家族成员HSP90AA1相互作用，HSP90AA1活性影响GABARAPL1蛋白的稳定性。此外，AP-MS方法还用于分析细胞器组成。对表达eGFP-LC3的MCF-7细胞采用SILAC标记揭示了依赖刺激的自噬体蛋白质组。在HEK293T细胞表达3xHA-TMEM192进行AP-MS分析确定了一种称为NUFIP1（nuclear FMR1 interacting protein 1）的蛋白质在饥饿诱导的自噬过程中从细胞核转移到了溶酶体/自噬体。翻译后修饰（phosphorylation，ubiquitination，sumoylation等）在特定的时空上调节自噬蛋白之间的相互作用。例如，通过AP-MS研究鉴定ULK1上的磷酸化位点。利用HEK293T细胞表达TAP标记的ULK1总共鉴定出16个新的磷酸化位点，其中还包括自磷酸化位点。ULK1的Ser867和Ser913处的磷酸化可能促进其与ATG13和RB1CC1的结合，从而形成活性的自噬起始复合物。亲和纯化方法与Western blot或MS结合使用，在无需预先分级的情况下即可分析所有细胞器中的蛋白质复合物。 表1 经过AP-MS鉴定得到的ATG蛋白 上述例子表明这些方法在识别蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰方面的有效性，但是这些方法也有缺点。例如，共纯化的污染物或非特异性结合蛋白质也能被富集，难以区真正的相互作用蛋白。前者可以通过对污染物库的数据分析，例如Contaminant Repository for Affinity Purification MS Data （CRAPome）识别污染物。另外由于过表达，诱饵蛋白容易出现诸如定位改变，蛋白错误折叠和聚集等问题。诱饵蛋白表达水平可以通过诱导型启动子来控制。此外，CRISPR操作能够实现在内源水平表达标记蛋白。使用CRISPR基因敲除或RNAi方法去除内源性蛋白质还可作阴性对照。另外必须严格评估亲和标签。对于内源蛋白质的分析，选择正确的哺乳动物细胞系也很重要。AP-MS数据不能对复合物结构提供见解，也无法区分直接和间接相互作用。另外亲和纯化只能分离出纳摩尔或更高亲和力的稳定或强力相互作用蛋白体。因此，动态，微弱和短暂的蛋白相互作用则难以被发现。 7.采用邻近标记技术研究弱蛋白质相互作用及其邻近蛋白 基于临近标记-质谱（PL-MS）的定量蛋白质组学可以识别和表征弱相互作用的PPI和邻近蛋白。为此，不同的酶类如生物素连接酶（biotin ligase），PTM连接酶（biotin ligase）和过氧化物酶（peroxidase）被用来标记邻近蛋白。这些酶与诱饵蛋白融合表达并催化邻近蛋白发生化学基团修饰（图4）。 生物素连接酶共价修饰临近蛋白质的赖氨酸残基。表达BioID（35.4 kDa）融合诱饵蛋白的细胞与生物素孵育16–24小时，以达到最大标记效率产生足够的近端生物素化蛋白质，经亲和纯化后采用LC-MS/MS分析。BioID的升级版本TurboID（35kDa）和miniTurbo（28 kDa）则在标记效率上有明显优势（见表二）。另一个生物素连接酶变体BirA，该连接酶用于鉴定新的RNA结合蛋白和邻近蛋白，这种方法被称为RNA-蛋白质相互作用检测（RNA-protein interactiondetection，RaPID）。BirA的另一变体是AirID，与BioID具有82％序列相似性，该变体在体外或体内使用更低的生物素浓度在来标记蛋白质（图4）。 表2 常见的临近标记方法 PTM连接酶通常在诱饵附近蛋白的赖氨酸残基上添加修饰。基于Pupylation的相互作用标签（Pupylation-based interaction tagging，PUP-IT）被开发用于检测膜蛋白的PPI。该方法包括诱饵蛋白与PafA融合表达，再与C端Gly-Gly-Glu序列的Pup（prokaryotic ubiquitin-like protein）变体共表达。Pup连接酶催化C末端Glu残基的磷酸化，导致其活化，后与诱饵附近蛋白质的赖氨酸残基结合。由于激活的Pup连接酶扩散性低，因此实现了较小的标记半径从而减少了背景。该方法的主要缺点是Pup连接酶的大小约为54 kDa，催化活性低。由76个氨基酸组成的NEDD8催化的Neddylation是一种类泛素的修饰，已被用于鉴定PPI（图4）。 过氧化物酶是在过氧化氢存在下催化氧化还原反应的酶，包括APEX（ascorbate peroxidase）和HRP（horseradish peroxidase）酶，它们在过氧化氢的存在下催化生物素酚（biotin-phenol）转化为生物素-苯氧基自由基（biotin-phenoxyl radical）。这种反应性自由基共价标记诱饵附近10nm半径内的蛋白富含电子的氨基酸，主要是Tyr，Trp，Cys和Phe。来自大豆的APEX2（28 kDa）进行了改造，以改善其催化活性，从而在哺乳动物细胞中使标记时间缩短到1分钟或更短。HRP（44 kDa），被用于EM（electron microscopy）和临近标记研究。由于HRP在细胞质中不活泼，因此它主要用于研究细胞表面分子和分泌途径，使用的技术包括selective proteomic proximity labeling assay using tyramide （SPPLAT）和enzyme-mediated activation ofradical sources （EMARS）。总体而言，由于APEX2在EM研究中的使用和快速的标记时间，该酶能够快速显示蛋白质-蛋白质互作并能够分析依赖于刺激物的蛋白相互作用组。但是，APEX2与HRP相比活性较低，并且对H2O2介导的抑制作用敏感（图4）。 图4 临近标记分类 临近标记连接酶可根据其活性分为三种类型：生物素连接酶，PTM连接酶和过氧化物酶。生物素连接酶（BioID，BioID2，AirID和BASU）对临近端蛋白质的赖氨酸残基进行生物素标记。在H2O2存在时，过氧化物酶（APEX2和HRP）将生物素酚转化为生物素-苯氧基自由基，后者可以标记富电子氨基酸残基，例如Tyr。PTM连接酶则将肽/蛋白质标签添加到临近蛋白质。 值得注意的是，结合蛋白质片段互补分析（protein fragment complementation assays，PCA）的临近标记技术取得了巨大的进步。来源于临近标记酶如BioID或APEX2的N端和C端无活性片段被融合到两个相互作用的诱饵蛋白上。诱饵蛋白之间的相互作用使临近标记酶得以重构，继而对邻近蛋白质进行修饰。该技术能够鉴定依赖于两种诱饵蛋白互作的其他相互作用。Split-BioID、split HRP、split-APEX2和split-TurboID均被开发优化用以蛋白质-蛋白质互作研究（图5）。 图5 常规临近标记-质谱与基于蛋白质片段互补分析（PCA）的临近标记技术 （A）生物素连接酶和过氧化物酶分别产生反应性生物素/生物素-酚中间体，标记蛋白质。（B）生物素连接酶和过氧化物酶的分裂变体用于鉴定近端蛋白。蛋白质的相互作用使连接酶的N/C末端片段非常接近，从而允许形成活性的完整酶。细胞裂解后，富集得到的生物素化的蛋白质通过LC-MS/MS分析。 迄今为止，有研究利用临近标记结合质谱的定量蛋白质组学来揭示参与自噬的蛋白质的功能（见表三）。含TBC结构域的蛋白质TBC1D14在内体循环有很强的作用，并且在过表达时负调控自噬体的形成。BioID与TBC1D14融合，结合质谱分析时发现TBC1D14与运输蛋白颗粒III（traffickingprotein particle III，TRAPP-III）的亚基TRAPPC8的相互作用。TRAPP-III调节ATG9从早期内体和高尔基体到ATG9区室的循环。TBC1D14的过表达导致TRAPPC8错误定位到内体小管上，并破坏了高尔基ATG9库，从而导致自噬体的形成受到抑制。APEX2融合ATG8后通过质谱定量蛋白质组学来分析自噬体的含量。APEX2-LC3C标记鉴定得到LC3C与MTX1（metaxin 1）蛋白质相互作用。MTX1与SAMM50结合，和MTX2形成分选和组装机械（sorting and assembly machinery，SAM）复合物。共定位研究和生化功能分析表明MTX1通过LC3C和SQSTM1清除受损的线粒体。最近，使用PL-MS鉴定到LC3在蛋白质分泌中的新作用。RNA结合蛋白和小的非编码RNA被包装到细胞外囊泡的过程依赖于MAP1LC3B和LC3。使用表达APEX2-GABARAP的细胞在细胞外囊泡中鉴定得到GABARAP，这些细胞外囊泡还含有与GABARAP相互作用的蛋白，进一步支持自噬与蛋白分泌之间的交互作用。基于TMT标记，APEX2与OPTN，OPTND474N和TAX1BP1进行融合的HeLa细胞中，识别得到线粒体吞噬过程中受体附近的蛋白质。结合CRISPR的基因筛选和线粒体通量分析，HK2（hexokinase-2）被认为与PINK1-PRKN及其他泛素化蛋白组成形成700-kDa的复合物支架，参与清除受损的线粒体。在受伤时，半乳糖凝集素（galectin）在维持，修复，去除和再生溶酶体的过程中发挥作用。半乳糖凝集素是具有CRD（carbohydrate recognition domain）结构域的β-半乳糖苷结合蛋白，此属性有助于感知由于膜损伤而引起的膜聚糖暴露。APEX2-LGALS9标记揭示LGALS9蛋白在检测溶酶体损伤中通过激活AMPK发挥作用。溶酶体损伤时，LGALS9从MAP3K7/TAK1激酶取代了去泛素酶USP9X，从而促进了K63多泛素化和继而活化。MAP3K7通过对AMPK Thr172的磷酸化激活AMPK，从而激活自噬。此外，APEX2-LGALS3标记揭示LGALS3蛋白通过自噬修复和清除内膜损伤。LGALS3在溶酶体膜受损时帮助募集ESCRT成分PDCD6IP/ALIX，促进PDCD6IP与CHMP4B的相互作用，共同介导溶酶体膜的闭合和分裂。 表3 临近标记与自噬研究 上述示例显示了PL-MS在解析自噬机制的强大作用。临近标记在特定的时空范围内提供了诱饵蛋白周围蛋白质组变化的信息，但是也导致了高背景。因此，区分假阳性和阳性互作非常重要。通常采用五种不同类型的对照来区分：（i）对无任何临近标记酶的细胞系也使用生物素/生物素-酚处理，（ii）临近标记酶与无关蛋白（例如GFP或RFP）融合，（iii）临近标记酶与失活的或突变的诱饵蛋白融合，（iv）临近标记酶与具有诱饵蛋白相似定位的区室特异性但无关的蛋白融合，以及（v）使用具有游离临近标记酶的细胞。对照（i）会导致较高的富集率，而假阳性的数量很高。相反，由于在对照（v）中使用了游离的临近标记酶，富集率低，并且假阴性的数目很高。因此，本文赞成（ii）-（iv）类对照：将临近标记酶标记的诱饵蛋白与临近标记酶标记的对照/无关蛋白进行比较。另外通过使用诱导型表达系统以控制诱饵蛋白的表达量以避免高表达水平造成的非特异性富集蛋白的背景信号。另外，基于BioID的方法中应该考虑赖氨酸残基的可用性以及APEX2方法中富含电子的氨基酸残基的可用性。过表达临近标记酶还会引发毒性，例如蛋白质聚集，错误定位和诱饵蛋白的功能失活等。因此，在研究复杂的生物学问题时，临近标记酶的选择和对照的设置尤为重要。 8.总结与展望 作者详述了基于质谱发现蛋白质-蛋白质相互作用在推动自噬机制研究的进展，并就各种技术的优缺点做出了讨论，详细解释了AP-MS和PL-MS的方法的原理和应用，并列举了自噬相关研究的示例。另外就质谱分析、蛋白质-蛋白质相互作用、翻译后修饰和脂质组学在解决自噬机制的核心问题做出展望。 |
|
|
