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【第169期】 《导读》2016年10月3日,大隅良典获诺贝尔生理学与医学奖,其贡献,是发现细胞自噬的原理机制。这对预防疾病和治疗由细胞自噬引起的疾病均有重要意义。笔者2008年曾就《自噬性程序性细胞死亡的研究》文章，人体细胞的死亡形式可有：1.细胞凋亡性死亡;2.细胞自噬性死亡;3.细胞坏死性死亡。这是目前我们认识细胞死亡的重要依据，而如何避免和防止细胞3种形式的死亡，又是医者的任务，为此，深入认识细胞死亡的机制，对我们提高防止疾病具有十分重要意义。本文虽然文献有些陈旧，但，不失普及科普知识，为了增加大家对自噬研究相关认识与兴趣，提供思路，现录于此，奉献读者，资源共享。 三、自噬与自噬体的形态及发生过程 自噬的发生过程以大自噬为例，可人为分为4 个阶段(图1) [11 ] ①分隔膜的形成。在饥饿、某些激素等因素刺激下, 有双层膜的杯状分隔膜开始在被降解物的周围形成。②自噬体的形成。随着分隔膜逐渐延伸, 将要被降解的胞浆成分完全包绕隔离开形成自噬体。③自噬体的运输、融合。自噬体形成后将其包裹物运输至溶酶体内与溶酶体融合形成自噬溶酶体, 这一过程并非简单的扩散, 而是通过细胞骨架微管网络系统的传输实现的[9，10 ] 。④自噬体的裂解。自噬体融合后最终被溶酶体中的水解酶溶解, 它首先经过囊泡酸化, 达到所需pH 值后，经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用[11]。 图1 自噬的形成过程简图[11] 四、泛素-蛋白酶控制系统 在哺乳动物自噬的自噬泡形成过程中，由Atg3, Atg5, Atg7, Atg10, Atg12 和LC3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程：Atg12-结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用[12]。Atg12-结合过程与前自噬泡(Preautophagosome)的形成相关，而LC3修饰过程对自噬泡(Autophagosome)的形成必不可少。泛素是在真核生物中普遍存在，具有很高的保守性的一种蛋白质。泛素化是细胞维持对那些受组成型调节和环境刺激产生的蛋白质水平的基本调节方式。泛素-蛋白酶体途径是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与调节细胞周期进程：细胞增生与分化，以及信号传导等多种细胞生理过程，因此细胞内蛋白质泛素化降解是蛋白质重要的转录后修饰方式之一。泛素化底物及其随后的降解过程贯穿于整个细胞的质膜系统，从细胞膜，内质网到核膜等。泛素化系统的作用位点主要位于细胞膜表面，内质网和细胞核。细胞泛素化与去泛素化过程的改变与肿瘤的发生密切相关。认识细胞内蛋白质泛素化降解过程，对治疗由泛素系统紊乱而引起的各种疾病，尤其是恶性肿瘤具有重要意义[13]。 目前发现参与泛素化反应的酶至少有E1，E2，E3 这三类：E1 即泛素活化酶(activating enzyme， Ub) ，在ATP(三磷酸腺苷)的参与下，E1 以其活性位点半胱氨酸的巯基与泛素的C 末端生成高能硫酯键，使泛素活化;E2 即泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes ，Ubs) ，是多个成员组成的蛋白家族，可接受E1传递来Ub , 在E3 的参与下将Ub 转移到底物上;即泛素2蛋白质连接酶(Ub-protein ligase) ，它分为两类，含HECT 结构域的E3 和含环酯结构域的E3 。泛素2蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway ,UPP) 不仅是一种破坏陈旧或损坏蛋白质的重要机制之一，而且还参与调节细胞周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原呈递、细胞增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程。UPP 水解底物的主要步骤为：识别被降解的靶蛋白;多个泛素分子共价结合到蛋白质底物上，形成多聚泛素链;通过26S 蛋白酶体复合物降解靶蛋白，同时释放游离的、可重新利用的泛素分子。 E3即泛素连接酶，近来又发现一类含U2box 结构域的E3。它们直接或间接与底物结合，促进Ub从与E2 的硫酯键中间产物转移到底物上，或转移到已与底物相连的泛素形成泛素链，作为底物降解的靶向性信号[13]。 在细胞自噬过程中，Atg12首先由E1泛素活化酶 (Ub)Atg7活化，之后转运至E2泛素结合酶(Ubs)Atg10，最后与Atg5结合，形成自噬体前体(Autophagosomal precursor)。LC3前体(ProLC3)形成后，首先加工成胞浆可溶性形式LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样，LC3-I也被Atg7活化，转运至第二种E2泛素结合酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3-II即被溶酶体中的水解酶降解。LC3是酵母自噬相关基因ATG8的类似物。哺乳动物细胞内源性Atg5和Atg12主要以结合形式存在;而胞浆可溶性LC3-I和膜结合型LC3-II的比例在不同组织和细胞类型变化很大。哺乳动物细胞自噬过程中两条泛素样加工修饰过程可以互相调节，互相影响。Atg5 基因缺陷的鼠胚胎干细胞缺乏Atg12-Atg5复合物，其LC3-I到LC3-II的修饰同时受到影响 [14]。 实验证明，在哺乳动物细胞HEK293中，Atg3除作用于其底物LC3, GATE-16 (Golgi-associated ATPase enhancer of 16 kDa，分子量为16kDa的高尔基体相关ATP酶增强子) 和GABARAP(γ-amminobutyric acid receptor associated protein，γ-氨基丁酸受体相关蛋白)外，还与Atg12和Atg12-Atg5复合物相互作用 [15,16]。虽然HEK293细胞中单独超表达游离的Atg12促进了LC3-I到LC3-II的修饰，过多Atg12-Atg5复合物的存在却可抑制上述修饰过程 [15]。在Atg7存在的情况下，HEK293细胞超表达哺乳动物Atg3可促进Atg12-Atg5复合物的形成[16]。这些研究结果提示：Atg3与Atg12和Atg12-Atg5复合物的相互作用在Atg12结合和LC3修饰两条泛素化修饰过程中起重要作用。哺乳动物Atg10除结合Atg12外，还与LC3相互作用[17]。Atg10与Atg12形成E2样底物中间物，但不与LC3结合。在Atg7存在下，超表达Atg10还可促进LC3-I到LC3-II的修饰[17]。酵母和哺乳动物的Atg7以同源二聚体形式存在[ 18,19]。 五、细胞自噬与细胞凋亡的关系 最初认为自噬与凋亡两种程序性细胞死亡方式在形态、生化指标、参与分子和机理方面均存在不同，近年研究提示，二者在某些情况下可以相互拮抗或促进，可先后发生或同时共存于同一细胞，相同诱导因素在不同细胞中可分别诱发自噬或凋亡;参与自噬和凋亡的分子也可能存在交叉，这些分子在自噬与凋亡两种程序性细胞死亡中可发挥正向或负向作用。研究的深入，自噬与凋亡之间的相互关系似乎变得越来越复杂了。有报道称Beclin 1可通过增强Caspase-9的活性加强化疗药物CDDP诱导的人胃癌细胞MKN28的凋亡，说明作为自噬重要调控基因的Beclin 1也可参与细胞凋亡的调控[20]。营养剥夺诱导的细胞自噬在Atg基因(Atg5, Atg6/Beclin 1, Atg10, Atg12)干扰RNA或自噬特异抑制剂剂(如3-MA)存在的情况下，细胞发生凋亡[21]。 广谱Caspase抑制剂zVAD 通过抑制Caspase-8活性，发挥诱导自噬性死亡作用，并且这种细胞死亡需要ATG7和Beclin 1基因参与[22]。 应用RNA干扰或同源重组技术将LAMP-2基因敲除，细胞在营养剥夺情况下，首先发生自噬，继而发生凋亡，同时伴随凋亡的典型特点，如线粒体跨膜电位的丧失、Caspase的活化和染色质的凝集[23]。 另研究证明LAMP-2基因缺陷的小鼠死亡率增加，幸存的小鼠出现多组织广泛的胞浆空泡[24]。凋亡刺激信号神经生长因子(NGF)去除或将胞嘧啶阿拉伯糖苷加入含NGF的交感神经的神经元，细胞在出现以DNA片断化为主的凋亡特点前，首先出现大量的自噬泡[25]。说明细胞凋亡与自噬互相交叉。 Pyo JO 等人的研究发现由IFN-γ或Atg5超表达诱导的Hela(人子宫颈癌传代细胞)细胞死亡之前，首先发生以大量胞浆空泡出现为主的自噬的形态学特点。由IFN-γ诱导的胞浆空泡的出现和细胞死亡可被3-MA或Atg5K130R超表达所抑制，而广谱胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk只能抑制细胞死亡，却不能抑制胞浆空泡的出现。这说明以胞浆空泡出现为主的自噬可继发Caspase依赖的细胞死亡。进一步的研究证明Atg5通过和FADD (Fas-associated protein with death domain，FADD) 的相互作用发挥促进自噬细胞死亡的作用, 而FADD是细胞膜受体Fas/FasL途径凋亡的重要参与分子[26]。另外，Bcl-2家族蛋白不仅参与凋亡形式的细胞死亡，还参与了对自噬形式细胞死亡的调控[27，28]。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配基(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)在人乳腺上皮细胞MCF-10A组织形成过程中，诱导自噬细胞死亡以形成中空的腔状结构，此过程同时伴随发生Caspase依赖的细胞凋亡事件[29]。 待续...... |
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