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对比两篇paper的结论 2016 Nature
2018 Cell Stem Cell Xudong Guo et.al. 2018 A Linc1405/Eomes Complex Promotes Cardiac Mesoderm Specification and Cardiogenesis. Cell Stem Cell. 5月11日，围绕这篇paper的帖子刷爆了朋友圈，教科书式的调控机制，堪称lncRNA机制研究的范本：《Cell Stem Cell丨同济康九红组揭示非编码RNA调控心肌分化和心脏发育过程的表观遗传机制》，该文章着重揭示了胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中，基因间长链非编码RNA（lincRNA1405）通过联合转录因子以及表观修饰分子，实现精确调控下游心肌特化关键转录因子表达的重要机制。 这篇2018的Cell Stem Cell跟2016的Nature矛盾啊！
有矛盾，有冲突，剧本才好看！但是，一定要仔细理清逻辑，不做标题党！ 小丫精读这篇paper，跟着作者一步步抽丝剥茧，学习怎样挖到核心机制；顺便辨别它能否驳倒2016 Nature的结论，最后请教第一作者Dr. Guo的看法。 表型：敲降linc1405会抑制mESC向心肌细胞分化 机制：lincRNA结合蛋白编码基因Eomes，介导Eomes/WDR5/GCN5调控复合物与靶基因Mesp1 enhancer的结合。 功能：调控心肌分化和心脏发育 一共做了这么多种实验 这些实验我好像也能做，就是搞不清先做哪个后做哪个。哪个是关键证据？哪个只是为了丰富文章内容？ 或者，别人的paper做啥我就做啥，攒了一大堆实验结果，还是不知道怎样讲故事。怎样提出假设？怎样设计实验证实假设模型？ 思路
下面细细来读paper的每一块内容，学习怎样讲故事，怎样开展试验，读的过程中解决了一些疑问，还有一些没想明白的，集中起来问作者。 第一步，查文献找线索，确认表型 文章一上来就讲linc1405的表达特征
结果表明Linc1405 Is Critical for Proper Cardiac Differentiation Figure 1. Linc1405 Is Critical for Proper Cardiac Differentiation 小丫：当初为啥选Linc1405？ Dr. Guo：选择Linc1405主要还是和Eomes的邻近关系，Eomes对心肌分化功能和下游基因比较明确的，有前人的细胞实验和动物实验结果 第二步，提出问题：Linc1405通过调控哪些基因从而影响了Cardiac Differentiation？ linc1405敲降 vs. Control，ESC、MES、CM三个时期。5套array，没有生物学重复。 做无重复array的小伙伴放心了，不影响发高分。 不过本文的表型那么明显，作为关键证据已经很说明问题了，这部分表达谱只是对表型的验证和补充。 我辈还是老老实实做RNA-seq，3次生物学重复来得踏实。 情理之中，富集分析发现Linc1405 Regulates a Core Network of Genes that Drive Cardiac Differentiation，跟第一步看到的表型一致。 Figure 2. Linc1405 Regulates a Core Network of Genes that Drive Cardiac Differentiation 敲降/过表达看到表型，而且引起了下游基因表达量变化，下面就该问机制了。 lncRNA的调控机制
其中cis最容易验证，也就是左右一两个邻居的工作量。 第三步，提出假设：linc1405通过结合cardiac lineage commitment的key factors，从而发挥作用 cardiac lineage commitment的key factors，旁边就有一个——Eomes，那就验证它吧！哦，其实作者本来关注的就是Eomes。
结果表明Linc1405 Interdependently Interacts with Eomes during Cardiac Mesoderm Specification Figure 3. Linc1405 Interdependently Interacts with Eomes during Cardiac Mesoderm Specification 第四步，具体是linc1405的哪段结合了Eomes？ linc1405有两个外显子，exon1和exon2
结果表明Exon 2 of Linc1405 Is Responsible for Eomes Binding and Cardiac Differentiation 与Eomes蛋白能结合的Exon 2能够促进心肌分化，进一步证明了linc1405和Eomes蛋白的结合关系对于心肌细胞的正常分化是非常重要的。 Figure 4. Exon 2 of linc1405 Is Responsible for Eomes Binding and Cardiac Differentiation 第五步，向下挖掘，linc1405跟Eomes结合，直接调控了谁？ 文献说，Mesp1是Eomes调节心肌胚层分化的关键靶基因，Mesp1通过结合多个心肌分化关键转录因子的启动子区域进而直接激活大量的心脏转录关键基因。Mesp1是不是linc1405/Eomes共同的靶基因呢？
结果表明Mesp1 Is a Functional Target of Linc1405 during Cardiac Differentiation
Figure 5. Mesp1 Is a Functional Target of linc1405 during Cardiac Fate Determination 第六步，调控机制的核心：怎样调控靶基因？有哪些factor参与？ 文献说，Eomes通过两个保守的T-box核心motif直接结合Mesp1：位于enhancer的MTbx，和位于转录起始位点的MTss（A）。 linc1405是否参与了这个调控呢？ChIP实验，in vivo，证实蛋白质-DNA的直接结合。
结果表明，Eomes在Mesp1基因enhancer的结合以及Mesp1 enhancer的形成都需要linc1405的参与，而在Mesp1 enhancer区域表观修饰环境的改变可能是影响Mesp1基因转录起始位点转录机器的组装以及Mesp1基因转录水平降低的重要原因。 linc1405是怎样参与enhancer调控的呢？
结果表明，WDR5和GCN5特异性地被linc1405招募到Mesp1基因enhancer上。 小丫：为什么选WDR5和GCN5？ Dr. Guo：选WDR5和GCN5是因为ChIP实验看到H3K27ac和H3K4me1/me3的变化。乙酰化酶我做了三个经典的，只有GCN5有和lncRNA结合，但普遍认识H3K27ac更多是p300的作用，我们也特意分析p300在该分化阶段的表达情况，确认其表达但不与RNA结合。组蛋白乙酰化酶对乙酰化位点的修饰是具有普适性，也有一些倾向性和偏好。 这个lincRNA-转录因子-表观遗传modulator复合物是怎样形成的呢？
结果表明，linc1405的exon2是关键区段，负责蛋白复合物的形成。 linc1405是怎样招募这些蛋白来到Mesp1基因的调控区的呢？
结果表明，linc1405 exon2可能引导了Mesp1基因enhancer区域Eomes/WDR5/GCN5复合物的形成。 调控模型清晰起来：lincRNA exon2的mut(3+4)可能已经足够组装Eomes/WDR/GCN5蛋白复合物并通过exon2末端的RNA序列引导该调控复合物在Mesp1 enhancer区的结合。 结论：Linc1405/Eomes Specifically Assembles TrxG Component and GCN5 as a Multi-protein Regulatory Complex at the Enhancer of the Mesp1 Gene
Figure 6. Linc1405/Eomes Specifically Assembles the TrxG Component and GCN5 into a Multi-protein Regulatory Complex at the Enhancer of the Mesp1 Gene 第七步，小鼠体内实验
结果表明，linc1405联合WDR5和GCN5，介导了Eomes在激活Mesp1表达中的独特作用，对心脏发育起到关键作用（I）。 The Linc1405/Eomes-Mediated Complex Is Located at the Primitive Streak and Coordinates Cardiogenesis
Figure 7. The Linc1405/Eomes-Mediated Complex Is Located at the Primitive Streak and Coordinates Cardiogenesis 回到本文标题提出的问题： 小丫：2016年的那篇Nature看到linc1405的promoter deletion确实降低了邻居Eomes的表达，说明linc1405对Eomes有cis调控。这个跟你的文章结果是一致的。 可是，插入pAS并未影响Eomes的表达，所以，貌似linc1405并不是作为RNA在起调控作用。这个跟你的结论相反，是因为体系不同吗？ 看你的结果，方方面面的证据都很充分的证明linc1405是作为RNA在起作用，这可不可以作为证据反驳2016那篇Nature的结论呢？ Dr. Guo：我的工作其实没有太关注linc1405对Eomes的转录影响，而是和Eomes协同去调控下游基因的表达，所以是作为RNA在发挥作用。而且我做过qPCR实验，发现干扰linc1405的表达水平对Eomes的下调作用并不明显，芯片结果也就是1到0.8的差异，并不显著。 《9年前Nature筛出来的那些lncRNA，后来怎么样了？》里的几篇文章我也都看过，确实linc1405和Eomes之间有作为cis调控的位置条件，包括Hi-C的分析结果，这也促使我们在早期的研究对两者之间的调控关系做了初步的分析，但我们的实验结果显示在mESC中干扰或者敲除linc1405本身的序列对Eomes的转录表达影响不大，这些实验证据也部分呈现在文章中，这也是引导我们从两者之间潜在的cis调控关系转向研究协同调控下游共同基因的重要原因。 扫清疑问，小丫的恶趣味又来了~ 小丫：遇到过思路或技术的瓶颈吗？最艰难的时期是在哪一步？ 怎样熬出来的呢？ Dr. Guo：实验几乎没有顺利的，要说艰难的时期还是构建lncRNA敲除动物的实验，动物实验本身周期较长，做了很久才拿到几只鉴定阳性的小鼠，但动物房的意外起火，花了大半年构建的小鼠全军覆没，当时我们整个实验室损失很惨重，多个课题都因此耽搁。这篇文章其实在2016年下半年就已经成文开始投稿，当时第一轮reviewer的意见中明确提出要补充敲除动物的实验，而17年重做敲除小鼠的进程也是不顺当，直到17年底才修回第一轮。而第二轮修改期限只有45天，过年那段时间也是和师弟在实验室加班加点补实验数据，才赶上杂志社的截止时间。 小丫：我感觉好像没有什么技术能难倒你们的，反正需要做什么实验，过一段时间你们就都做出来了。而且你们实验室人都特nice，互相帮助，气氛特别好。哎，你们最近招不招人啊？ Dr. Guo：研究员、副研究员、助理研究员、博士后，都在招： 1) 研究员年薪 32 - 40万； 小丫：我来补充隐形福利，吃在同济（红烧肉、大排...）、带小孩落上海户口、上同济小学。 回复“红酒”，直达康九红课题组招聘页面。 感谢Dr. Guo友情审阅本文和对小丫疑问的耐心解答。 |
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