流式软件FlowJo VX10的超详细图文讲解

一

安装教程

软件下载以后，解压缩，找到这个图标，鼠标左键双击，打开软件。

 就是下面这个工作页面：

二

FlowJo VX10使用教程

流式数据分析的过程就是在流式图上选门和设门的过程。

门：在流式图上人为设定的区域。

设门：用门选择某一特性细胞的过程。

处理流式数据

（1）打开保存的数据，不同的流式仪器用的系统不同，例如BD CellQuest Pro 系统（calibur）；DIVA系统（canto、Fortessa、Aria、celesta），但数据分析用的都是FlowJo VX软件，数据保存时选择FCS格式。直接把FCS格式的文件夹拖进空白区域。

操作结果如下：

（2）调节补偿（在上样时可以在DIVA系统上自动/手动调节补偿，但有时因为仪器预约时间问题，故也可以在数据分析时用Flow Jo 调节补偿）

①点击compensation，把单染管拖到空白区域

②单染管拖到空白区域后，补偿编辑器被点亮

③点击补偿编辑器，出现以下界面

FlowJo VX默认设的门与我们的目的细胞群不在一个位置，需要自己调整，左键双击A图，重新设门；再左键双击B图，调整阴阳门的位置，如下图所示：

注意：

A. 调补偿时，选择区域门工具，阴性门和阳性门设在细胞群分布的中心区域，也就是峰顶，不用把整个峰都包含住；

B. 如果单染管的直方图没有明显的双峰，设门时，阴性门和阳性们的距离尽可能远；

C.   调补偿时尽量选择强阳性的信号，不在乎阳性群体细胞数量的多少，也就是直方图中Y轴的高度，关键是要与阴性群分的开。

④补偿调完以后，点击“Apply To Group---All sample”，运用到所有样品中

（3）正向设定逻辑门

①左键双击调过补偿的fcs格式数据出现流式散点图（建议首先对空白组细胞先处理），如下图所示

②设门，根据实验目的选择合适的设门工具，（以淋巴细胞群为例，圈住并命名，点击OK确定）

③一直按着鼠标左键，将已处理的文件lymphocytes拖到All samples 中，进行批量处理

结果如下：

④左键双击圈门部位（淋巴细胞群），根据实验目的以及染料的荧光激发/发射波长，选择流式图合适的横坐标和纵坐标，以横坐标为percp-cy5.5-CD3，纵坐标为SSC为例，看CD3+Tcell的比例

⑤将CD3 T也拖到lymphocytes中，批量处理（每分析完一级，都可以拖到上一级，进行批处理），并且可以通过点击右上角绿色按钮（⑤标记处）查看所有样品的设门是否合适，因为有些样品会进行对照处理，如若不合适，可手动微调。

⑥左键双击圈门部位（CD3T细胞群），以横坐标为FITC-CD4，纵坐标为APC-cy7-CD8为例，看CD4+T cell（TH）和CD8+Tcell（TC）细胞的比例，同上面操作一样，将TH和TC拖到CD3T中，进行批量处理，同时点击右上角绿色按钮查看设门是否合适。

  

⑦左键双击圈门部位（CD8+Tcell群（TC）），以横坐标PE-cy7-CD27，纵坐标PB-CD95为例，看记忆干细胞（TSCM）的比例。同样，将TSCM拖到TC中，进行批处理。

（4）图片批量导出

以记忆干细胞（TSCM）为例，右键点击A图，出现B图，点击“copy to Layout Editor”，会另外弹出一个窗口C

然后右键点击图片，出现“Ancestry”，可查看前面的设门情况

结果如下：

接着点击Layout Editor页面的”Batch”，进行批处理，结果如下：

再接着点击Layout Editor页面中的“File-save lmage”，选择图片导出的格式，一般PDF的分辨率较高

（5）数据批量导出

点击Flow Jo操作页面中的“Table Editor”，会另外弹出一个窗口，结果如下：

接着点击鼠标左键，将分析完的一个样品数据（例如1号样品）按照逻辑关系（lymphocytes—CD3T—TH/TC）依次拖到Table Editor中，并且进行命名。

然后点击 Table Editor 页面中的“Display”进行数据的批处理，结果如下：

最后点击左上角的Table Editor 页面中的“File-save as ”将数据保存为Excel格式，用spass等软件进行统计分析。

流式图解析

可根据实验需要自行选择,在此，举几个例子。

①  在这个页面内，鼠标左键点击“options-type-pseudocolor”为伪色图。

②点击“options-type-Histogram”为单参数直方图，

-横坐标代表荧光信号或散射光信号的相对强度，可以是线性或对数坐标。

-纵坐标一般是相对细胞数。

③点击“options-type-contour plot”为等高线图

④点击“options-type-Density plot”为密度图

⑤点击图形窗口界面的“T”按钮，X轴选择“PB-CD3”,Y轴选择“BV510-CD4”, 为双参数散点图

-X轴为该细胞一参数相对含量

-Y轴为该细胞另一参数的含量

自定义参数轴窗口

分析数据时，发现细胞群有压轴的情况，例如下图：

因为细胞群是压在X 轴上，故点击Y轴上的“T”按钮，选择“自定义参数轴（customize Axis）”，打开自定义参数轴窗口

其中，①换坐标轴的类型：Linear，Logarithmic，Biex

②  通过增加和减少按钮调整坐标轴的范围

③  手动输入坐标轴的范围，包括最大值和最小值

④  当使用Biex坐标轴时，调整Extra Neg. Decades值的大小，

⑤  当使用Biex坐标轴时，调整Width Basis值的大小

在这里，我们将Extra Neg. Decades（④）由默认的0调为1，点击“Apply”按钮，得到结果如下图所示：原来压轴的数据完全显示出来了