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启动子DNA甲基化的预测工具和引物设计 前两期，我们分别介绍了UCSC获取启动子序列【工具篇】手把手教你使用UCSC获取基因启动子、外显子、内含子序列以及通过启动子序列预测基因的转录因子【工具篇】TRANSFAC：助力机制深入研究。关于启动子的另一个重要的研究方向，就是启动子的表观遗传调控机制。本期将介绍启动子DNA甲基化的预测工具和引物设计，为大家的研究工作增添一个新的思路。 01 表观遗传学及DNA甲基化概述 表观遗传学定义：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平和功能发生变化，并产生可遗传的表型。 我们从这个定义可以总结出表观遗传学的三个特点： 1、可遗传 2、可逆的 3、 DNA序列不变 目前表观遗传学的研究内容主要有DNA 甲基化、组蛋白修饰、RNA修饰、基因印迹等。  （图片来源于维基百科） 脊椎动物中的DNA甲基化通常发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸 -鸟嘌呤位点，即DNA序列中鸟嘌呤紧跟在胞嘧啶后面），该甲基化导致胞嘧啶向5-甲基胞嘧啶的转化。CpG甲基化由DNA甲基转移酶催化形成。人类DNA约有80-90％的CpG位点发生甲基化，但是在CpG岛的区域（约65％的CG残基组成的区域）发生甲基化的情况较少。 当启动子DNA发生高度甲基化时，基因转录受到抑制，基因表达下降。 目前针对甲基化的检测方法有： 亚硫酸盐修饰测序法（BSP） 甲基化特异性 PCR（MSP） 焦磷酸测序法（Pyrosequencing）等。 BSP：检测基因的位置≤350bp，可精确了解每一位点甲基化程度精确，但要大量克隆测序。 MSP：只能定性，定量不精确，不能了解待测位点甲基化程度； Pyrosequencing：检测基因的位置≤60bp，可精确了解每一位点甲基化程度。 02 启动子甲基化在线预测 本期介绍的甲基化预测工具MethPrimer，是由The Li Lab构建的在线平台。该平台围绕DNA甲基化和表观遗传学的研究，提供了许多工具和数据库，包括用于设计各种基于亚硫酸氢盐转化的PCR的引物和探针的工具、预测CpG岛和操纵序列等。目前该网站已升级为MethPrimer 2.0 （http://www./methprimer2/），本文将对2.0版进行介绍。
第一步 选择“Design PCR primers”模块  第二步 粘贴启动子序列，选择MSP以及CpG island prediction，提交即可。  Tips： 1、本在线软件目前适用于BSP和MSP的引物设计，Pyrosequencing的引物设计需要焦磷酸测序仪配套的软件进行设计。本例以MSP引物设计为例。 2、引物的参数可先选择默认参数，然后根据引物的结果调整相关参数。
第三步 分析预测结果，选择引物   Tips： 如果引物设计结果不理想，可返回上一界面调整引物参数，如引物的大小、Tm值等。 03 甲基化引物设计原则和注意事项 1、引物长度18~24bp； 2、引物之间有非CpG的C的个数； 3、引物以6~7个CpG为目标； 4、避免引物间互补或自身形成发卡结构。  小结 从近几年国自然中标的基金可以看出，表观遗传学方面的研究热度有上升趋势，DNA/RNA甲基化、组蛋白乙酰化等是研究中的宠儿。大家不妨在日常的文献阅读中关注表观遗传方向的文章，结合自己专业的研究领域，说不定可以有新的Idea。 |
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