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作者：张虹 张爽 王颖 李东 徐玲 刘倩 段学宁 刘荫华 李挺 目的 运用2013版美国临床肿瘤学会（ASCO）/美国病理医师学院（CAP）乳腺癌HER2检测指南，回顾性地对1501例浸润性乳腺癌（IBC）的HER2的免疫组织化学（IHC）及荧光原位杂交（FISH）检测结果进行再评估，分析2013版指南对检测结果判读的影响。 方法 按照2007版ASCO/CAP指南全面规范手术标本处理及HER2检测技术流程。所有IBC手术标本均常规行HER2 IHC检测，对IHC检测显示HER2不确定的患者推荐其行FISH检测。参照两版指南，分别评估1501例IBC患者的HER2检测结果。 结果 1501例行IHC染色，其中348例行FISH检测。两版指南评估HER2状态阳性率分别为23.05%、23.52%；不确定率分别为11.59%、12.52%；阴性率分别为65.36%、63.96%。采用2013版指南后，阳性率和不确定率分别增加0.47%、0.93%，而阴性率减少1.40%。其中IHC检测结果的阳性率分别为17.99%、18.12%（＋0.13%）、不确定率分别为32.51%、32.91%（＋0.40%），阴性率分别为49.50%、48.97%（–0.53%）；FISH检测结果的阳性率分别为27.59%、29.02%（＋1.43%），不确定率分别为1.15%、及3.74%（＋2.59%），阴性率分别为71.26%、67.24%（–4.02%）。 结论 2013版ASCO/CAP指南的采用将使乳腺癌HER2检测阳性率及不确定率有所提高，阴性率下降，尤其对FISH检测结果的影响较大，由于采用HER2平均拷贝数指标，阳性和不确定病例将增加。本组数据中IHC判读结果的变化与指南的预测一致，而FISH判读结果的变化尚需进一步探讨。 位于第17号染色体的表皮生长因子受体2（HER2）基因编码受体型酪氨酸激酶生长因子跨膜糖蛋白，其过表达可启动下游信号通路，刺激细胞增殖并抑制凋亡。15%～20%的乳腺癌存在该基因扩增，而HER2基因过表达的乳腺癌病例绝大多数（>90%）由扩增所致。 大量临床证据表明乳腺癌HER2状态具有独立的预后及药物治疗方面的预测意义。Ross等对107篇文献中39730例乳腺癌的病例资料复习后发现，HER2状态阳性者相对危险度是阴性癌的2.74，无病生存者相对危险度均值为2.04。多数研究认为HER2状态可预测内分泌治疗疗效，雌激素受体与HER2状态双阳性者使用三苯氧胺治疗常产生耐药性。HER2阳性患者对拓扑异构酶抑制剂蒽环类化疗药的治疗敏感性升高，实验结果证明35%的HER2阳性乳腺癌具有维持DNA稳定结构的拓扑异构酶Ⅱα的共扩增，认为HER2状态还可作为预测蒽环类药物治疗敏感性的替代指标。 HER2状态对乳腺癌预后预测，尤其是筛选靶向治疗患者具有重要意义，因此准确检测和判读HER2状态成为病理医师亟需面对的重要挑战。目前，公认的检测技术包括免疫组织化学（IHC）对HER2蛋白表达的检测及荧光原位杂交（FISH）对HER2基因扩增状态的检测。IHC使用广泛，但其技术流程受多种主、客观因素影响；FISH技术敏感性、定量性强，但仍存在实验室间的检测差异。这些问题曾使HER2检测处于混乱状态，因此，许多国际学术组织就HER2检测结果的准确性进行讨论并陆续发布指南，其中2007年美国临床肿瘤学会（ASCO）/美国病理医师学院（CAP）联合发布指南，全面规范乳腺癌HER2检测。该指南在世界范围广泛应用，有效促进了检测规范性的提高。2013年ASCO/CAP更新指南内容，对HER2检测结果的判读标准进行了部分修订。 我们按照2007版ASCO/CAP指南全面规范乳腺癌的标本处理及HER2检测结果的评估，并运用2013版指南，回顾性再评估1501例浸润性乳腺癌（IBC）HER2的IHC及FISH检测结果，分析2013版指南对检测结果判读的影响。 材料与方法 1．病例来源： 病例来自2009年10月至2013年10月北京大学第一医院病理科存档资料，为北京大学第一医院乳腺疾病中心诊断的IBC 1501例，其中新诊断1416例，转移复发85例。病理标本2439例：粗针穿刺活检1296例，手术切除标本1143例，其中895例在我院行粗针穿刺活检后手术切除（726例）或术前新辅助化疗后手术切除（169例）。余606例在我院粗针穿刺活检诊断后转院、或外院初诊后来本院诊治而仅有一次标本。 2．标本处理及制片： 标本处理根据2007版ASCO/CAP指南的推荐办法进行。粗针穿刺针采用14～18G针型常规穿刺4条组织。标本离体后，立即送病理科。手术标本经病理医师行大体检查，5mm书页状切开，纱布分隔，放入10倍体积4%缓冲甲醛液并记录固定开始时间。限制冷缺血时间1h内，固定时间6～48h。固定后标本规范取材，石蜡包埋，4μm切片。 3．IHC检测方法及结果判读： 1501例共2439个粗针穿刺及手术切除标本均常规行HER2 IHC检测。选取包含正常乳腺组织作为阴性内对照的肿瘤组织蜡块；多灶肿瘤选取其中最大的组织蜡块；组织学形态不一致时选择有代表性或不同形态的多个蜡块进行检测。既往HER2阴性、不确定及阳性病例的乳腺癌组织芯片作为外对照。 IHC染色试剂及仪器：依据HER2（4B5，Ventana公司）抗体及ultra View Universal DAB检测试剂盒说明，使用BenchMark XT（Ventana公司）全自动免疫组织化学染色机。 再评估原则：由于小标本组织固定较充分，因此尽量采用粗针穿刺检测结果入组。同时具有粗针穿刺和手术切除标本者，两者结果不一致时选评分高者入组。 评分标准：2007版指南：0：无着色细胞；1＋：肿瘤细胞不完整膜着色或≤10%细胞完整膜着色；2＋：>10%肿瘤细胞呈弱或不均匀完整膜着色或10%～30%细胞呈强度完整膜着色；3＋：>30%肿瘤细胞呈均匀一致强度完整膜着色。2013版指南：0：无着色细胞或≤10%肿瘤细胞呈模糊不清/微弱不完整膜着色；1＋：>10%肿瘤细胞呈模糊不清/微弱不完整膜着色；2＋：>10%肿瘤细胞呈弱–中度和/或不完整膜着色或≤10%细胞呈强度完整膜着色；3＋：>10%肿瘤细胞呈强度完整膜着色。结果判断：阳性：3＋；不确定：2＋；阴性：0/1＋。 4．FISH检测方法及结果判读： 对IHC不确定患者，推荐其进一步行FISH检测。部分患者自己要求行FISH检测。1501例中348例行FISH检测。 制片：根据组织学及IHC染色片定位，选取4mm×4mm面积浸润癌组织，避开导管内癌成分；若IHC片肿瘤着色方式不均匀，选取不同代表区并记录所占比例。采用Vysis PathVysion（Abbott公司）双探针试剂盒（HER2位点，17q12，橘红色；CEP17，17p11.1–q11.1，绿色）。切片脱蜡水化，NaSCN液（1mol/L）80℃热修复，蛋白酶0.1mg/mL，37℃消化；10μL杂交液（Thermobrite杂交仪，Iris公司）42℃孵育16h；DAPI复染细胞核。荧光显微镜（Axio Imager M2，Zeiss公司）观察，图像软件（Metasystems,Ikaros and Isis公司）采集图片。 判读标准：计数至少4个区域20～80个浸润性肿瘤细胞，记录每个细胞橘红色及绿色荧光信号的数量，原始数据存档备用。计算平均每个细胞核HER2和CEP17的拷贝数及其比值。细胞橘红色或绿色信号拷贝数≥15个者定义为簇状。分别采用2007版及2013版ASCO/CAP指南进行评估。2007版指南（双探针法）：阴性：HER2/CEP17<1.8；不确定：her2 ep17介于1.8～2.2之间，此时需增加计数细胞数；阳性：her2/cep17="">2.2。2013版标准：阴性：HER2/CEP17<><4.0><2.0且her2拷贝数为（4～6）> 结果 1．根据IHC检测结果评估HER2蛋白表达： 根据2007版及2013版ASCO/CAP指南，HER2状态评估结果分布见表1（图1），阳性（3＋）分别为270例（17.99%）及272例（18.12%），不确定（2＋）488例（32.51%）及494例（32.91%），阴性（0/1＋）743例（49.50%）及735例（48.97%）。两版指南结果判读的一致率为99.33%，不一致病例共10例（0.67%），其中2例分别有15%、20%肿瘤细胞呈强度完整膜着色，由2＋调整为3＋（2例均未能行FISH检测），另8例有20%～80%肿瘤细胞呈弱–中度不完整膜着色，由1＋调整为2＋。348例FISH检测的病例，根据2007版指南，其IHC检测结果分布为：阳性（3＋）21例（6.03%），不确定（2＋）318例（91.38%），阴性（0/1＋）9例（2.59%）。根据2013版标准，仅1例由1＋调整为2＋，其FISH检测结果HER2/CEP17＝1.23，HER2拷贝数2.58/细胞，两版指南均判定为阴性。 2．FISH检测结果评估： 2007版指南将HER2/CEP17比值作为唯一参数，而2013版标准则同时参考HER2/CEP17及HER2拷贝数。348例FISH检测结果分布见表2（图2），HER2状态阳性分别为96例（27.59%）及101例（29.02%），不确定4例（1.15%）及13例（3.74%），阴性248例（71.26%）及234例（67.24%）。两版指南结果判读的一致率为94.54%，不一致病例共19例，占5.46%。其中3例HER2/CEP17为2.04～2.16、2例HER2拷贝数为6.25及6.75/细胞，2013版指南判断为阳性；13例HER2/CEP17为0.98～1.70，但HER2拷贝数为4.03～5.73，新标准为不确定；1例HER2/CEP17＝1.91，2013版指南判断为阴性。  1501例IBC，根据2007版指南HER2总阳性率为23.05%（346/1501），其中IHC阳性270例，不确定488例中318例行FISH检测76例阳性（23.90%）；根据2013版指南HER2总阳性率为23.52%（353/1501），其中IHC阳性272例，不确定494例中319例行FISH检测81例阳性（25.39%）。348例同时行IHC及FISH检测的病例，两种方法阴性一致率为100.00%（IHC阴性病例2007版指南为9例，2013版指南为8例，FISH结果均为阴性），阳性一致率为95.24%（新旧指南IHC阳性病例均为21例，FISH结果均为20例阳性，1例阴性）。1例IHC阳性而FISH阴性患者为一老年（74岁）女性，浸润性导管癌Ⅱ级（7分），其原发灶与4年后锁骨上淋巴结转移灶HER2检测结果一致：IHC肿瘤细胞呈弥漫一致强度完整膜着色，而FISH检测HER2/CEP17＝1.44（3.45/2.4）和1.42（3.20/2.25）。患者6年后由于复发转移死亡。 讨论 自抗HER2靶向药问世以来，HER2检测结果是遴选药物适宜治疗患者的唯一因素，假阴性结果可能使曲妥珠单抗治疗潜在获益患者失去治疗机会，而假阳性结果导致患者持续1年无效治疗、付出高昂费用并可能产生毒副作用。如何通过规范检测技术提高HER2状态检测的准确率成为病理学医师亟需解决的重要问题。 1998年以来，FDA陆续认证了HER2检测试剂盒并建立评估标准：要求根据浸润癌细胞膜IHC染色强度和分布来确定HER2状态。阴性（0/1＋）：无着色细胞或≤10%肿瘤细胞膜着色；>10%肿瘤细胞呈模糊不清/微弱不完整膜着色；弱阳性（2＋）：>10%肿瘤细胞呈弱–中等强度完整膜着色；强阳性（3＋）：>10%肿瘤细胞呈强度完整膜着色。FISH双探针技术标记采用HER2/CEP17评估：≥2.0为阳性；<2.0为阴性；单探针技术采用her2拷贝数评估：≥4.0><4.0> 在欧洲，英国国家健康临床优化研究院（NICE）于2000年公布了HER2检测推荐标准（以下称英国指南），并于2004年更新。英国指南从标本处理、试验方法、结果评估及实验室质控多方面阐述规范。推荐采用缓冲甲醛液固定，否定FDA推荐的Bouin等其他固定液，其评估体系与FDA标准相似。 2007年ASCO协同CAP成立专家组，在广泛调查的基础上，综合英国指南构架及其他机构的推荐方法，于2007年初在其官方杂志上公布了研究报告和检测指南。专家组指出HER2检测质量方面存在的问题，确认IHC和FISH为最佳方法，并对标本处理、技术流程标准化制定了规范。指南指出原FDA评分系统特异性不足，进行了修订：IHC阳性标准提高到>30%的肿瘤细胞呈强度完整膜着色，10%～30%的肿瘤细胞呈强度完整膜着色为不确定（2＋），需FISH检测复检；FISH阳性标准提高到HER2/CEP17>2.2（双探针法）或HER2拷贝数>6.0/细胞（单探针法）；增加了FISH不确定结果HER2/CEP17介于1.8～2.2之间（双探针）或HER2拷贝数介于（4～6）/细胞（单探针），此时需增加计数细胞数。2007版ASCO/CAP指南意义重大，在世界范围内有效控制了假阳性及假阴性率。 对HER2状态检测评估，我们近年来尝试过不同方法及试剂以探讨、比较不同评估标准。2009年以来全面建立了针对乳腺癌标本处理及HER2检测技术流程并规范实施，采用FDA认证的试剂及方法。我们收集2009年10月以来的1501例IBC，HER2总阳性率为23.05%，其中IHC检测阳性率17.99%。本组IHC与FISH检测总阳性率及IHC阳性率均略高于国内外报道（15.0%～20.0%），但低于国内人群的数据（IHC阳性率22.8%～23.3%）。本组数据是否可以代表中国人群分布特性，或本组与国际资料比较中晚期病例相对高，值得进一步探讨。IHC与FISH检测方法间的阳性及阴性一致率分别达95.24%（20/21）及9/9，符合指南质量控制规定。    2013版指南对FISH结果的判读将阳性HER2/CEP17从≥2.2降为≥2.0。据此本组3例（HER2/CEP17为2.04～2.16）由不确定变为阳性；此外，2007版指南中对于双探针FISH仅依据HER2/CEP17，认为拷贝数受细胞有丝分裂指数等多重因素影响，比值更能反映HER2扩增状态。但随着对少见基因异常及第17号染色体多倍体的认识，发现仅考虑HER2/CEP17将掩盖HER2实际扩增而产生假阴性。本组2例由于CEP17拷贝数高（5.88及6.10），HER2/CEP17<2.0，但her2拷贝数≥6.0><2.0，但her2拷贝数介于（4.0～6.0）> 综上，运用2013版ASCO/CAP指南对本组1501例IBC行HER2状态再评估，总体阳性率从23.05%提高到23.52%，增加了0.47%，其中IHC检测阳性率增高0.13%（2/1501），FISH检测阳性率增高1.43%（5/348）；总不确定率从11.59%提高到12.52%，增加0.93%，其中IHC检测增高0.40%（6/1501），FISH检测增高2.59%（9/348）；总阴性率分别为65.36%及63.96%，减少1.40%，其中IHC检测减少0.53%（8/1501），FISH检测减少4.02%（14/348）。新版指南将使乳腺癌HER2状态阳性率及不确定率有所提高，阴性率下降，对FISH检测结果的影响较大，由于采用HER2拷贝数指标，将增加阳性和不确定病例。本组数据中IHC检测数据的阳性率变化与指南预测一致，而FISH检测结果的变化尚未检索到相关报道。 参考文献：略 【本站为非盈利学术交流平台，部分资料来源于网络，如涉及版权问题请及时联系管理员处理；所有文章仅供公益交流，不代表本站立场。欢迎提供素材、资料等，投稿邮箱：tougao@，一经采纳将给予稿费。】 |
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