手把手教会你计算 Masson 染色胶原容积分数！（赠送超值福利）

 众所周知，Masson 染色是用于显示组织中纤维的染色方法之一，主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色。染色结果为：胶原纤维呈蓝色（如光绿液染色为绿色），胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。

对 Masson 染色的分析通常是计算胶原容积分数 (Collagenvolume fraction，CVF)，即胶原阳性的蓝色面积与组织总面积的百分比。

笔者在医学科研工作者聚集之地丁香园论坛发现许多关于 Masson 染色分析的提问，其中一篇名为「Imagej 对 Masson 染色半定量分析」的热帖一年多来点击量高达 11368 次，但遗憾的是作者并未给出详细分析步骤。

既然大家都对何使用 Imagej 对 Masson 染色进行分析感兴趣，今天阿牛就和大家分享使用 Imagej 对 Masson 染色进行分析的两种不同方法，并在这两种方法的基础上和大家分享面积计算的基本思路。

Imagej 作为免费开源软件，能够适用不同电脑操作系统，本次分享在 Windows 下 Imagej 1.50b 进行。

一、直接阈值选定法分析胶原容积分数

分析步骤：

1、打开 Imagej 软件，点击 File >> Open 打开待分析 Masson 染色图片，以心肌 Masson 染色图片为例；

2、图片左上角信息显示为图片名称为 Masson.tif，图片的长宽为 735x480 pixels（像素），图片格式为 RGB 彩色模式，图片大小为 1.3MB。

图片格式不仅可以使 RGB 格式还可以转化为 HSB 格式，也就是色度、饱和度和亮度模式。

观察心肌 Masson 染色图片可知胶原纤维呈蓝色与心肌红色存在明显区分，提示我们可以根据 HSB 模式将胶原纤维提取出来得到胶原的面积。

点击 Image >> Adjust >> Threshold 进行颜色阈值选定。调节颜色阈值选定（红色代表选中）所有蓝色胶原：

点击 Threshold >> Select >> Analyze >> Measure，得到胶原面积：

整张图片的面积：735x480=352800 pixels2。

3、胶原容积分数为胶原阳性的蓝色面积与组织总面积的百分比，现在已知胶原面积，接下来需要计算组织总面积，注意不是图片总面积！

打开图片 >> Image >> Type >> 8-bit：

点击 Image >> Adjust >> Threshold 进行阈值选定，图片为白色背景故不勾选 Dark background：

点击 Analyze >> Set Measurements，检查已选择 Area 与 Limit to threshold，即只测量阈值选定范围的面积，否则测量的为整张图片的面积：

点击 Analyze >> Measure，得到组织总面积：

胶原容积分数=135319/295662 x 100% =45.8%。

二、IHCToolbox 法分析胶原容积分数

分析步骤：

1、IHC Toolbox 插件的下载与安装：

打开Imagej官网：https://imagej./ij/，点击 Plugins：

下载网址：https://imagej./ij/plugins/ihc-toolbox/index.html，插件官网提示放于 Plugins 文件夹重启软件即可：

Installation:

Download IHC_Toolbox.jar to the ImageJ plugins folder, or  subfolder. Then restart ImageJ, and there will be a new IHC Toolbox command.

2、Imagej 软件 >> File >> Open 打开待分析心肌 Masson 染色图片。使用矩形选框在目的胶原的蓝色中画一矩形选框，表示对蓝色的胶原感兴趣：

点击 Plugins >> IHC Toolbox，进入软件界面：

点击 Training，调节 Color Chooser 使所有蓝色选中：

3、将得到的蓝色胶原图片转化为灰度图片，Image >> Type >> 8-bit >> 点击 Image >> Adjust >> Threshold 进行阈值选定，图片为白色背景故不勾选  Dark background：

点击 Analyze，Measure，得到蓝色胶原面积：

组织总面积与上相同 295662 平方像素，胶原容积分数=136642/295662 x 100% =46.2%。

结语

两种不同方法均能够很好的测量胶原容积分数，其结果分别为 45.8% 与 46.2%，结果一致性高。

胶原容积分数的计算本质上是两个面积的计算，通过上面两种方法我们不难看出面积计算的基本思路是两步走：先选中、后测量。

先通过颜色阈值或者插件选定选中目的颜色——蓝色，再进行面积或其他参数的测量。

今天虽然是以 Masson 染色为例进行了面积计算，但通掌握面积分析思路今后可以举一反三，例如下面的图分析蓝色孔隙的面积：

希望对大家有所帮助。

参考文献：

Biomarker Detection in Whole Slide ImagingBased on Statistical Color ModelsJie Shu,Guoping Qiu, Mohammad Ilyas and Philip Kaye. Biomarker Detection in Whole SlideImaging Based on Statistical Color Models. The MIDAS Journal- ComputationalImaging Biomarkers for Tumors (CIBT), http://www./browse/publication/758, 2010