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外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的研究发现，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。 做过生物实验的人都知道，好的样本意味着实验已经成功了一半。那么如果开展外泌体miRNA测序或芯片项目，如何收集样本并送样呢？下面我们针对不同的样本做个简单介绍。 注意事项： ?1. 用于分离外泌体的样品不能加入任何RNA保护剂（如Trizol）。 ?2. 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 ?3. 冻存过的血浆和血清样本可以用于分离外泌体，并进行电镜观察。 ?4.准备分选外泌体的样本的预处理十分重要，必须保证有效去除所有细胞碎片及其它不需要的膜结构。因此要求全血不可冻融，取血后尽早制备血浆或血清，血浆或血清可以放-80℃保存，但应避免反复冻融。 1. 血清样品 注意：收集血清样本一定不要加入抗凝剂。 血清是血液凝固析出的淡黄色透明液体。 1) 轻轻将全血滴入洁净的离心管或用采血管采血（不能加抗凝剂）。 2) 室温静置30分钟，4℃条件下，静置3~4小时，可见血块析出（也可放置 4℃冰箱过夜）。 3) 4℃条件下，1900×g离心10分钟，可见淡黄色血清，取出上清后可再4℃条件下，3000×g离心10分钟，最大程度保证血清质量。 4) 将血清冻存于-80℃。 5) 干冰寄送样本。 提示：为保证实验结果，送样量最好4 mL 以上（大致需全血8-10mL） 2. 血浆样品 注意：收集血浆样本用于操作RNA一定不要用肝素抗凝管。因为肝素会影响后续的酶反应。 1) 用采血针和抗凝管（含EDTA）抽取全血，轻柔混匀后于室温或4℃保存。最好在1小时内进行下一步处理。 2) 4℃条件下，1900×g离心10分钟，小心取上清即为血浆，最后500μL左右丢弃。得到的血浆再次离心，条件为4℃，3000×g，15min，小心吸出血浆，注意不要碰到底部和侧面的沉淀物。 3) 将血浆冻存于-80℃。 4) 干冰寄送样本。提示：送样量最好4 mL以上（大致需全血8-10mL）。 3. 细胞上清 注意：细胞培养基必须使用去除 exosome（de-exosome）的血清或者无血清培养基（例如Thermo Fisher的SFM） 1) 细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间，贴壁细胞密度在70%-80%，悬浮细胞密度在60%-70%。 2) 对于贴壁细胞，去除原有培养基，换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基；对于悬浮细胞，300×g，4℃，10分钟收集细胞，使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养。 3) 细胞继续培养24-48小时，根据细胞的生长速度确定收取上清时间。 4) 收集细胞上清，300×g，4℃，离心10分钟；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片。 5)3000×g，4℃，再次离心15分钟，确保将细胞或者细胞碎片去除干净。 6) 取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片（重要！），合并相同的细胞培液上清样品，装入无菌的玻璃瓶，可在4℃短期保存（1-2天），长期保存可冻存于-80℃。建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离，保存在4℃和-80℃都会对产量有一定的影响。 提示：送样量最好在15-20 mL 以上 |
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