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PennDiff:Detecting Differential Alternative Splicing and Transcription by RNA Sequencing 可变剪接和转录是产生转录组多样性的主要机制。差异可变剪接和转录（DAST）描述了不同条件下不同isoforms的不同方式，可以补充表征基因调控的差异表达。 然而只有一小部分RNA-seq读数可用于isoforms，因此DAST的分析仍然具有挑战性。目前，已经开发了几种方法来检测基于外显子和基于基因的DAST，例如DEXSeq和rMATS，但它们常因许多isoforms的基因的影响而不能保证准确性。 PennDiff，利用基因结构和预先估计的isoforms相对丰度的信息，从而使用RNA-seq数据检测DAST的方法（PennDiff源代码和用户指南可从https://github.com/tigerhu15/PennDiff免费下载）。 PennDiff的基本思想： 通过折叠isoforms共享相同的替代外显子来估计exon-inclusion水平，并根据exon-inclusion水平定量可变剪接或转录。其中，对于PennDiff基于注释（RefSeq和Ensembl）估计的exon-inclusion水平，并且Spearman相关系数在 logit scale上分别为0.87和0.76，估计值与真实值具有良好的一致性。 2.exon-inclusion水平的Gaussian copula回归 在Gaussian copula回归中，使用广义线性模型对exon-inclusion水平的边际分布进行建模，然后应用多元正态分布将广义线性模型连接在一起以考虑DAST分析中的相关性。 在基于外显子的性能分析中，将PennDiff与其他两种基于外显子的方法（包括DEXSeq和rMATS）进行了比较。所有方法都使用相同的输入数据集运行，在病例和对照之间设定平均exon-inclusion水平差异的阈值t1，如果exon-inclusion水平差异大于t1，则外显子被认为是DAST事件，并以I类错误率和power进行三种方法的比较。 根据不同的t1值可以看出DEXSeq的power一直低于PennDiff（图1）。同样采用相同的方法PennDiff比rMATS也具有更大的power。 图1：具有不同样本大小和基因注释的基于外显子的方法的I型错误和power。计算基于输入数据中的所有DAST和非DAST外显子。在5％显着性水平评估显着性。具有真实外显子水平差异> 0.1的外显子被定义为真正的DAST外显子。（A）5 vs 5基于RefSeq注释。（B）20 vs 20基于RefSeq注释。（C）基于Ensembl注释的5对5。（D）基于Ensembl注释的20对20。 在基于基因的性能分析中，将PennDiff与其他三种基于基因的方法进行了比较（包括IUTA，SplicingCompass和Cuffdiff）。当病例和对照之间的平均Hellinger距离大于t1时，基因被认为是DAST。 图2：具有不同样本大小和基因注释的基于基因的方法的I型错误和power。计算基于输入数据中的所有DAST和非DAST基因。在5％显着性水平评估显着性。真正的Hellinger距离> 0.1的基因被定义为真正的DAST基因。 （A）5 vs 5基于RefSeq注释。 （B）20 vs 20基于RefSeq注释。 （C）5 vs 5基于Ensembl注释。 （D）20 vs 20基于Ensembl注释的。 4.RNA-seq数据模拟以评估PennDiff的性能及RT-PCR验证。 为了评估PennDiff在实际环境中的表现，我们分析了人类诱导多能干细胞研究中产生的RNA-seq数据集，并且使用PennDiff, DEXSeq, IUTA和SplicingCompass进行DAST分析。 图3：（A）通过用于人诱导的多能干细胞（iPSC）与iPSC衍生的巨噬细胞（iPSDM）的不同方法检测的DAST基因数量。 （B）在两个人供体的样品中SYTL2中可变剪接的外显子chr11：5422155-85422275的RT-PCR验证我们进行了RNA-seq研究。表中显示exon-inclusion水平基于凝胶图像估计。 （C）在M4和M8是两个研究对象中基因SYTL2的IGV图。 由此可以看出PennDiff几个优势： 首先，对外显子进行分组避免了对来自相同isoforms的“外显子”的多重测试。 其次，它利用exon-inclusion水平估计中的所有可用reads，这与仅使用结读数的方法不同。 最后，折叠异构体共享相同的替代外显子减少了isoforms表达估计不确定性的影响。 PennDiff能够检测外显子和基因水平的DAST，对真实RNA-seq数据集的模拟和分析也表明PennDiff具有良好控制的I型错误率，并且比现有方法（包括DEXSeq，rMATS，Cuffdiff，IUTA和SplicingCompass）更强大。 |
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