【原】原创10000+生信教程大神给你的RNA实战视频演练

准备工作

1. 安装conda

推荐使用偷懒方法，比如安装miniconda软件，下载地址：https://mirrors.tuna./anaconda/miniconda/ 这样就可以使用它安装绝大部分其它软件。

但是在中国大陆的小伙伴，需要更改镜像源配置

1. conda config --add channels https://mirrors.tuna./anaconda/pkgs/free

2. conda config --add channels https://mirrors.tuna./anaconda/cloud/conda-forge

3. conda config --add channels https://mirrors.tuna./anaconda/cloud/bioconda

4. conda config --set show_channel_urls yes

2. 安装软件

为了避免污染linux工作环境，推荐在conda中创建各个流程的安装环境，比如：

1. conda create -n rna python=2 #创建名为rna的软件安装环境

2. conda info --envs #查看当前conda环境

3. source activate rna #激活conda的rna环境

先读文献调研，得到转录组分析需要用到的软件列表；

• 质控

• fastqc , multiqc, trimmomatic, cutadapt ,trim-galore

• 比对

• star, hisat2, bowtie2, tophat, bwa, subread

• 计数

• htseq, bedtools, deeptools, salmon

如果你对一个软件不了解的话，那么安装之前在https://bioconda./recipes.html，检索该软件包是否存在，或者使用 conda search packagename进行检索。

但是我帮你确定好了下面的软件安装代码是可行的！！！

1. conda install -y sra-tools

2. conda install -y trimmomatic

3. conda install -y cutadapt multiqc

4. conda install -y trim-galore

5. conda install -y star hisat2 bowtie2

6. conda install -y subread tophat htseq bedtools deeptools

7. conda install -y salmon

8. source deactivate #注销当前的rna环境

转录组流程

step1: sra2fastq

下载SRA数据

新建一个名为 SRR_Acc_List.txt的文档，将SRR号码保存在文档内，一个号码占据一行。文件可以在我的GitHub下载获取：https://github.com/jmzeng1314/GEO/blob/master/airway/SRRAccList.txt

• prefetch下载数据

1. wkd=/home/jmzeng/project/airway/ #设置工作目录

2. source activate rna

3. cat SRR_Acc_List.txt | while read id; do (prefetch  ${id} &);done

4. ps -ef | grep prefetch | awk '{print $2}' | while read id; do kill ${id}; done #在内陆下载速度很慢，所以我杀掉这些下载进程

• 拷贝事先下载好的sra数据

1. mkdir $wkd/raw

2. cd $wkd/raw

3. ls /public/project/RNA/airway/sra/*  | while read id; do ( nohup fastq-dump --gzip --split-3 -O ./ ${id} & ); done

4. source deactivate

• 得到的SRA数据如下

1. /public/project/RNA/airway/sra/

2. ├── [1.6G]  SRR1039508.sra

3. ├── [1.4G]  SRR1039509.sra

4. ├── [1.6G]  SRR1039510.sra

5. ├── [1.5G]  SRR1039511.sra

6. ├── [2.0G]  SRR1039512.sra

7. ├── [2.2G]  SRR1039513.sra

8. ├── [3.0G]  SRR1039514.sra

9. ├── [1.9G]  SRR1039515.sra

10. ├── [2.1G]  SRR1039516.sra

11. ├── [2.6G]  SRR1039517.sra

12. ├── [2.3G]  SRR1039518.sra

13. ├── [2.0G]  SRR1039519.sra

14. ├── [2.1G]  SRR1039520.sra

15. ├── [2.4G]  SRR1039521.sra

16. ├── [2.0G]  SRR1039522.sra

17. └── [2.2G]  SRR1039523.sra

• sra格式转fastq格式

格式转还用到的软件是fastq-dump

1. for i in $wkd/*sra

2. do

3.        echo $i

4.        nohup fastq-dump --split-3 --skip-technical --clip --gzip $i &

5. done

• 得到fastq数据如下

原始数据是双端测序结果，fastq-dump配合--split-3参数，一个样本被拆分成两个fastq文件

1. ├── [1.3G]  SRR1039508_1.fastq.gz

2. ├── [1.3G]  SRR1039508_2.fastq.gz

3. ├── [1.2G]  SRR1039509_1.fastq.gz

4. ├── [1.2G]  SRR1039509_2.fastq.gz

5. ├── [1.3G]  SRR1039510_1.fastq.gz

6. ├── [1.3G]  SRR1039510_2.fastq.gz

7. ├── [1.2G]  SRR1039511_1.fastq.gz

8. ├── [1.2G]  SRR1039511_2.fastq.gz

9. ├── [1.6G]  SRR1039512_1.fastq.gz

10. ├── [1.6G]  SRR1039512_2.fastq.gz

11. ├── [950M]  SRR1039513_1.fastq.gz

12. ├── [952M]  SRR1039513_2.fastq.gz

13. ├── [2.4G]  SRR1039514_1.fastq.gz

14. ......

15. ├── [1.5G]  SRR1039522_1.fastq.gz

16. ├── [1.5G]  SRR1039522_2.fastq.gz

17. ├── [1.8G]  SRR1039523_1.fastq.gz

18. └── [1.8G]  SRR1039523_2.fastq.gz

step2: check quality of sequence reads

fastqc生成质控报告，multiqc将各个样本的质控报告整合为一个。

1. ls *gz | xargs fastqc -t 10

2. multiqc ./

• 得到结果如下

1. ├── [4.0K]  multiqc_data

2. │   ├── [2.1M]  multiqc_data.json

3. │   ├── [6.8K]  multiqc_fastqc.txt

4. │   ├── [2.2K]  multiqc_general_stats.txt

5. │   ├── [ 16K]  multiqc.log

6. │   └── [3.4K]  multiqc_sources.txt

7. ├── [1.5M]  multiqc_report.html

8. ├── [236K]  SRR1039508_1_fastqc.html

9. ├── [279K]  SRR1039508_1_fastqc.zip

10. ├── [238K]  SRR1039508_2_fastqc.html

11. ├── [286K]  SRR1039508_2_fastqc.zip

12. ├── [236K]  SRR1039510_1_fastqc.html

13. ├── [278K]  SRR1039510_1_fastqc.zip

14. ├── [241K]  SRR1039510_2_fastqc.html

15. ├── [292K]  SRR1039510_2_fastqc.zip

16. ......

17. ├── [220K]  SRR1039522_fastqc.zip

18. ├── [234K]  SRR1039523_1_fastqc.html

19. ├── [273K]  SRR1039523_1_fastqc.zip

20. ├── [232K]  SRR1039523_2_fastqc.html

21. └── [274K]  SRR1039523_2_fastqc.zip

每个idfastqc.html都是一个质量报告，multiqcreport.html是所有样本的整合报告

step3: filter the bad quality reads and remove adaptors.

• 运行如下代码，得到名为config的文件，包含两列数据

1. mkdir $wkd/clean

2. cd $wkd/clean

3. ls /home/jmzeng/project/airway/raw/*_1.fastq.gz >1

4. ls /home/jmzeng/project/airway/raw/*_2.fastq.gz >2

5. paste 1 2  > config

• 打开文件 qc.sh ，并且写入如下内容

trim_galore，用于去除低质量和接头数据

1. source activate rna

2. bin_trim_galore=trim_galore

3. dir='/home/jmzeng/project/airway/clean'

4. cat $1 |while read id

5. do

6.        arr=(${id})

7.        fq1=${arr[0]}

8.        fq2=${arr[1]}

9. nohup $bin_trim_galore -q 25 --phred33 --length 36 --stringency 3 --paired -o $dir  $fq1 $fq2 &

10. done

11. source deactivate

• 运行qc.sh

1. bash qc.sh config #config是传递进去的参数

• 结果显示如下

1. ├── [2.9K]  SRR1039508_1.fastq.gz_trimming_report.txt

2. ├── [1.2G]  SRR1039508_1_val_1.fq.gz

3. ├── [3.1K]  SRR1039508_2.fastq.gz_trimming_report.txt

4. ├── [1.2G]  SRR1039508_2_val_2.fq.gz

5. ├── [2.9K]  SRR1039509_1.fastq.gz_trimming_report.txt

6. ......

7. ├── [2.9K]  SRR1039522_1.fastq.gz_trimming_report.txt

8. ├── [1.4G]  SRR1039522_1_val_1.fq.gz

9. ├── [3.1K]  SRR1039522_2.fastq.gz_trimming_report.txt

10. ├── [1.4G]  SRR1039522_2_val_2.fq.gz

11. ├── [2.9K]  SRR1039523_1.fastq.gz_trimming_report.txt

12. ├── [1.7G]  SRR1039523_1_val_1.fq.gz

13. ├── [3.1K]  SRR1039523_2.fastq.gz_trimming_report.txt

14. └── [1.7G]  SRR1039523_2_val_2.fq.gz

step4: alignment

star, hisat2, bowtie2, tophat, bwa, subread都是可以用于比到的软件

• 先运行一个样本，测试一下

1. cd $wkd/test

2. source activate rna

3. 
   

4. #比对流程

5. id=SRR1039508

6. hisat2 -p 10 -x /public/reference/index/hisat/hg38/genome -1 ${id}1_val_1.fq -2 ${id}2_val_2.fq -S ${id}.hisat.sam

7. subjunc -T 5 -i /public/reference/index/subread/hg38 -r ${id}1_val_1.fq -R ${id}2_val_2.fq -o ${id}.subjunc.sam  

8. bowtie2 -p 10 -x /public/reference/index/bowtie/hg38 -1 ${id}1_val_1.fq -2 ${id}2_val_2.fq -S ${id}.bowtie.sam

9. bwa mem -t 5 -M  /public/reference/index/bwa/hg38 ${id}1_val_1.fq ${id}2_val_2.fq > ${id}.bwa.sam

• 批量比对代码

1. cd $wkd/clean

2. 
   

3. ls *gz|cut -d"_" -f 1 |sort -u |while read id;do

4. ls -lh ${id}1_val_1.fq.gz   ${id}2_val_2.fq.gz

5. hisat2 -p 10 -x /public/reference/index/hisat/hg38/genome -1 ${id}1_val_1.fq.gz -2 ${id}2_val_2.fq.gz -S ${id}.hisat.sam

6. subjunc -T 5  -i /public/reference/index/subread/hg38 -r ${id}1_val_1.fq.gz -R ${id}2_val_2.fq.gz -o ${id}.subjunc.sam

7. bowtie2 -p 10 -x /public/reference/index/bowtie/hg38 -1 ${id}1_val_1.fq.gz -2 ${id}2_val_2.fq.gz -S ${id}.bowtie.sam

8. bwa mem -t 5 -M /public/reference/index/bwa/hg38 ${id}1_val_1.fq.gz ${id}2_val_2.fq.gz > ${id}.bwa.sam

9. done

• sam文件转bam

1. ls *.sam|while read id ;do (samtools sort -O bam -@ 5  -o $(basename ${id} ".sam").bam   ${id});done

2. rm *.sam

• 为bam文件建立索引

1. ls *.bam |xargs -i samtools index {}

• reads的比对情况统计

1. ls *.bam |xargs -i samtools flagstat -@ 10  {}  >

2. ls *.bam |while read id ;do ( nohup samtools flagstat -@ 1 $id >  $(basename ${id} ".bam").flagstat & );done

3. source deactivate

• 最终结果显示如下

1. ├── [1.8G]  SRR1039508.bowite2.bam

2. ├── [2.9M]  SRR1039508.bowite2.bam.bai

3. ├── [ 444]  SRR1039508.bowite2.flagstat

4. ├── [ 10G]  SRR1039508.bowite2.sam

5. ├── [1.7G]  SRR1039509.bowite2.bam

6. ......

7. ├── [2.0G]  SRR1039521.bowite2.bam

8. ├── [2.9M]  SRR1039521.bowite2.bam.bai

9. ├── [ 444]  SRR1039521.bowite2.flagstat

10. ├── [ 10G]  SRR1039521.bowite2.sam

11. ├── [2.3G]  SRR1039522.bowite2.bam

12. ├── [3.0M]  SRR1039522.bowite2.bam.bai

13. ├── [ 444]  SRR1039522.bowite2.flagstat

14. ├── [ 12G]  SRR1039522.bowite2.sam

15. ├── [2.5G]  SRR1039523.bowite2.bam

16. ├── [3.0M]  SRR1039523.bowite2.bam.bai

17. ├── [ 444]  SRR1039523.bowite2.flagstat

18. └── [ 14G]  SRR1039523.bowite2.sam

step5: counts

1. mkdir $wkd/align

2. cd $wkd/align

3. source activate rna

4. for fn in {508..523}

5. do

6. featureCounts -T 5 -p -t exon -g gene_id  -a /public/reference/gtf/gencode/gencode.v25.annotation.gtf.gz -o counts.txt SRR1039$fn.bam

7. done

8. source deactivate

• 得到的文件如下

1.      1 # Program:featureCounts v1.6.1; Command:"featureCounts" "-T" "5" "-p" "-t" "exon" "-g" "gene_id" "-a" "/public/reference/gtf/gencode/ge

2.      2 Geneid  Chr     Start   End     Strand  Length  /home/llwu/RNA/airway/2.align/bowite2/SRR1039523.bowite2.bam

3.      3 ENSG00000223972.5       chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1    11869;12010;12179;12613;12613;12975;13221;13221;13453   12227;1

4.      4 ENSG00000227232.5       chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1  14404;15005;15796;16607;16858;17233;17606;17915;18268;2

5.      5 ENSG00000278267.1       chr1    17369   17436   -       68      9

6.      6 ENSG00000243485.4       chr1;chr1;chr1;chr1;chr1;chr1   29554;30267;30366;30564;30976;30976     30039;30667;30503;30667;31097;31109

7.      7 ENSG00000237613.2       chr1;chr1;chr1;chr1;chr1        34554;35245;35277;35721;35721   35174;35481;35481;36073;36081   -;-;-;-;-

8.      8 ENSG00000268020.3       chr1    52473   53312   +       840     0

9.      9 ENSG00000240361.1       chr1    62948   63887   +       940     0

10.     10 ENSG00000186092.4       chr1    69091   70008   +       918     0

step5: DEG

• 差异分析之前需要首先对转录组上游分析得到的文件 all.id.txt 进行一定程度的检查，代码如：

1. rm(list = ls())

2. options(stringsAsFactors = F)

3. a=read.table('all.id.txt',header = T)

4. tmp=a[1:14,1:7]

5. meta=a[,1:6]

6. exprSet=a[,7:ncol(a)]

7. colnames(exprSet)

8. a2=exprSet[,'SRR1039516.hisat.bam']

9. 
   

10. library(airway)

11. data(airway)

12. exprSet=assay(airway)

13. colnames(exprSet)

14. a1=exprSet[,'SRR1039516']

15. group_list=colData(airway)[,3]

16. 
    

17. a2=data.frame(id=meta[,1],a2=a2)

18. a1=data.frame(id=names(a1),a1=as.numeric(a1))

19. library(stringr)

20. a2$id <- str_split(a2$id,'\\.',simplify = T)[,1]

21. tmp=merge(a1,a2,by='id')

22. png('tmp.png')

23. plot(tmp[,2:3])

24. dev.off()

25. 
    

26. library(corrplot)

27. png('cor.png')

28. corrplot(cor(log2(exprSet+1)))

29. dev.off()

30. 
    

31. library(pheatmap)

32. png('heatmap.png')

33. m=cor(log2(exprSet+1))

34. pheatmap(scale(cor(log2(exprSet+1))))

35. dev.off()

• 检查通过之前就可以正式做差异分析以及后续的富集分析，代码参考：https://github.com/jmzeng1314/my-R/blob/master/10-RNA-seq-3-groups/hisat2mm10htseq.R 其实都在GitHub哦，视频讲解了这个代码如何使用。