|
责编丨迦溆 图片来源于：https://discovery. 人类精子发生过程承载着将父源基因组遗传信息进行精准代际传递的任务，也是人类自身繁育和物种延续的重要保障。全世界约有10-15%的育龄夫妇存在不孕不育的问题，其中，男性因素约占50%左右。阐明人类精子发生过程中的基因表达调控机制是发育生物学的重大科学问题，对理解、诊断和治疗男性不育相关疾病至关重要。 8月30日，南方医科大学赵小阳课题组、北京大学BIOPIC中心汤富酬课题组以及北京大学第三医院乔杰课题组合作，联合在Cell Stem Cell上在线发表了题为Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis的研究论文。首次从单细胞水平系统阐明了人类精子发生过程中的基因表达调控网络和细胞命运转变路径，绘制了人类精子发生的高精度单细胞转录组图谱，解析了成年男性全部生殖细胞类型及其关键的分子标记，并初步探索了将单细胞转录组技术用于人类非梗阻性无精症的研究和诊断。这是该研究团队继2017年在Cell Stem Cell上发表论文揭示人类胎儿期生殖细胞基因表达特征后【1】，在人类生殖发育领域里取得的又一重要进展。 该研究团队首先分离并获取了正常成年男性和梗阻性无精症患者的2,854个睾丸细胞，对其进行了高精度的单细胞转录组测序分析，并结合t-SNE、PCA和Monocle2【2】等多种生物信息学分析方法对这些数据进行深度挖掘，在国际上首次完成了人类精子发生过程中的细胞命运转变和基因表达图谱的绘制。在此基础上，研究团队进一步对一例非梗阻性无精症患者的174个睾丸细胞进行研究，确定了该无精症患者睾丸中的各种细胞类型及其与正常人睾丸中对应的细胞类型相比发生的基因表达异常，为男性不育的临床诊断提供了新的思路。 该项研究主要有以下几方面的重要成果： 1.人类精子发生过程中的细胞命运转变和基因表达动态 该研究选取临床捐献的成年男性睾丸组织为材料，通过随机挑选或流式分选两种策略获取睾丸组织的单细胞样品，随后进行高精度单细胞转录组测序，并借助计算生物学方法对单细胞转录组数据进行深度挖掘（图1a）。经过非监督聚类分析，发现在2,854个睾丸细胞中共存在17种不同的细胞类型，其中14种为各个分化阶段的睾丸生殖细胞，另外3种为睾丸微环境体细胞（图1b）。利用众多特异的标志基因对所有细胞类型进行身份鉴定，最终确定出3种精原细胞，包括精原干细胞（SSC）、分化中的精原细胞（Diff.ing SPG）、分化后的精原细胞（Diff. ed SPG）；7种精母细胞，包括3种细线期精母细胞（L1~L3）、偶线期精母细胞（Z）、粗线期精母细胞（P）、双线期精母细胞（D）、分裂期初级精母细胞及次级精母细胞（SPC7）；以及4种精子细胞（S1~S4）（图1c）。通过Monocle2对人类精子发生过程进行拟时间发育分析，发现由以上14种生殖细胞构成的发育路径与经典的生精上皮发育过程高度吻合（图1d）。至此，该研究借助高精度单细胞转录组测序技术完整地描绘了人类精子发生过程中细胞命运转变的精确过程和基因表达变化的动态图谱，为进一步深度解析人类精子的发生过程奠定了重要的研究基础。
图1：（a）项目的研究流程示意图；（b）17类睾丸细胞转录组的t-SNE分析图；（c）人类生精过程中标志基因的动态表达变化图；（d）人类睾丸生殖细胞的拟时间发育图 2.确定人类睾丸生殖细胞各发育阶段特异表达的新基因 基于t-SNE分析，该研究共发现了14种人类睾丸生殖细胞。通过进一步分析，研究者找到了人类睾丸生殖细胞各发育阶段特异表达的基因（图2a），根据这些基因的表达模式能够将特定阶段的细胞类型与其他阶段进行区分。通过RNA原位杂交和免疫荧光染色实验，研究者进一步确认，HMGA1在曲线精管基底膜的精原细胞中处于活跃的转录状态（图2b），SCML1主要在DMC1 的细线期精母细胞中高表达（图2c），CCDC112主要在粗线期精母细胞中高表达（图2d），而TEX29主要在早期精子细胞中处于活跃的转录状态（图2e）。这些各发育阶段特异表达的新基因的发现，为将来鉴定或分选特定阶段的人类睾丸生殖细胞提供了重要的依据和线索。 图2：（a）人类睾丸生殖细胞各发育阶段特异基因的表达趋势图；（b）睾丸组织HMGA1的RNA原位杂交与DDX4的免疫荧光染色定位；（c）睾丸组织SCML1与DMC1的免疫荧光染色定位；（d）CCDC112与γH2AX的免疫荧光染色定位；（e）睾丸组织TEX29的RNA原位杂交与DDX4、PNA的免疫荧光染色定位 3.人类睾丸细胞的单细胞转录组数据库为非梗阻性无精症的分子诊断提供了重要的参照标准 人类睾丸的单细胞转录组图谱的绘制，使研究者对非梗阻性无精症的深入研究成为可能。通过对一例非梗阻性无精症患者的174个睾丸细胞的单细胞转录组分析，发现这些细胞主要聚类到睾丸体细胞类型中的支持细胞和MIX细胞（图3a）。对该例非梗阻性无精症患者的体细胞差异表达基因进行分析，发现了包括BEX1、FATE1在内的一系列可能与该疾病发生相关的差异基因（图3b，3c）。利用Gene Ontology（GO）对差异基因进行分析后发现，非梗阻性无精症患者的体细胞中高度富集细胞凋亡、氧化应激等生物学过程（图3d）。随后，免疫荧光染色结果证实了该例非梗阻性无精症患者睾丸组织中细胞凋亡表征明显。通过对该例无精症的探索，建立了基于单细胞转录组分析的无精症分子诊断平台，为研究不育症致病机制和临床诊断提供了新的思路。 图3：（a）生精上皮完整男性的2,854个睾丸细胞及NOA患者的174个睾丸细胞组成的t-SNE图；（b）NOA患者与生精上皮完整男性支持细胞的差异基因火山图；（c）NOA患者与生精上皮完整男性MIX细胞的差异基因火山图；（d）NOA患者的睾丸体细胞上调基因中富集的生物学过程 综上，该研究在国际上首次成功绘制了人类精子发生的高精度单细胞转录组图谱，为人类精子发生、减数分裂调控机制的研究、无精症的分子诊断和临床治疗提供了全新的视角。 南方医科大学汪妹博士，北京大学博士生柳溪溪、陈依东，深圳大学常港博士，广州医科大学附属第三医院安庚博士为该论文的并列第一作者，北京大学乔杰教授，汤富酬教授和南方医科大学赵小阳教授为该论文的共同通讯作者。 参考文献 1. Li, L. et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis Maps Development of Human Germline Cells and Gonadal Niche Interactions. Cell Stem Cell 20, 858-873 e854 (2017). 2. Trapnell, C. et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat Biotechnol 32, 381-386 (2014).
|
|
|
