MDM2在恶性肿瘤中的研究进展

【摘要】MDM2为鼠双微体基因,是近几年发现的一种新的癌基因,对细胞生长具有调节作用。MDM2主要通过与

p53蛋白结合形成MDM2-p53负反馈环,发挥p53依赖活性。另外,MDM2还参与调节细胞增殖和凋亡的多条通路,发挥p53非依赖的作用。MDM2基因异常与恶性肿瘤发生发展相关,其异常表达有可能是疗效和预后的预测指标。MDM2可以作为恶性肿瘤治疗中的潜在靶点,若干种小分子化合物正处在临床前和早期临床试验中,这种干预MDM2-p53相互作用的策略为恶性肿瘤的治疗带来新的前景。

【关键词】MDM2;p53;

恶性肿瘤;

Nutlins

中图分类号:R730

文献标识码:A

文章编号:1009－0460(2012)03－0277－05

Research progress of murine doubleminute 2gene in malignance

-mei ,WU Qiong ,QIN Shu-kui．Department of Medical Oncology ,the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College ,Bengbu 233000,China

sponding author :WU Qiong ,E-mail :[e-mail]

【Abstract 】MDM2gene (murine doubleminute 2)was discoveried in recent years ,which has a moderating effect on cell growth．MDM2forms a MDM2-p53negative feedback loop mainly through combinding with p53protein ,displaying a p53dependent activity．Be-sides ,MDM2is also involved in regulating cell proliferation and apoptosis of multiple pathways ,displaying p53-independent activities．MDM2gene abnormality is associated with the development of malignancy ,and its abnormal expression may be used as a predictor of effi-cacy and prognosis．MDM2may be served as a potential target for cancer therapy ,several small molecule compounds are in preclinical and early clinical trials．The strategies which interfere with MDM2-p53interaction brings new prospects for cancer treatment．

【Key Words 】MDM2;

p53;

Malignancy ;

Nutlins

鼠双微体基因2(murine doubleminute 2,MDM2)最初由Cahilly-Snyder 等从含有双微体的自发转化小鼠Balb /c3T3成纤维细胞系(3T3DM )中克隆出来的一个高度扩增的基因

[1]

。该基因在进化过程中保守,不同物种细胞染色体上都

有其同源序列。MDM2主要与p53蛋白结合,调节MDM2-p53负反馈环。此外,它还参与调节细胞增殖和凋亡相关的信号通路,发挥p53非依赖的生物学活性。在多种恶性肿瘤中,MDM2基因发生异常改变,其过表达促进了肿瘤的发生和发展

[2-9]

,并与预后不良相关。本文概述了MDM2基因的

作用机制以及在恶性肿瘤中的研究进展。

1MDM2基因和蛋白质结构

1992年,Oliner 等在染色体12q13-14上鉴定出人MDM2

基因。人MDM2基因的cDNA 开放读框为5'端到第1784位核苷酸,起始密码ATG 从312位核苷酸开始,第181 185位密码子为核定位信号,第305 322位密码子为酸性活化域。

在MDM2基因内存在两个启动子p1和p2,

p1在编码基因的上游,可组成性地表达,p2位于第一个内含子中,p53通过p2启动子附近的2个p53结合位点调节MDM2的转录。

MDM2基因有不同的mRNA 剪接方式,表达多种蛋白,如p57、p76、p85、p90等,在体内起主要生物学作用的是p90。进一步研究发现MDM2蛋白具有4个功能区:Ⅰ区包括N 端约100个氨基酸残基,是MDM2-p53基因相互结合的部位,也可以直接结合到基因启动子上,激活基因转录;Ⅱ区为高度酸性区域,

能与核糖体15蛋白及5srRNA 结合;Ⅲ区含有一个锌指结构,具有转录因子的活性,促进细胞由G 1期进入S 期;Ⅳ区含有一个环指结构,可介导蛋白质之间的相互作用,也能结合

DNA 或RNA ,参与细胞周期调控,促进细胞增殖[10]

。

2

MDM2作用机制

2.1

p53依赖的途径

p53是一个在多种应激条件下激活

的转录因子,结构上包括转录活性区域、富含脯氨酸的N 端

区域、DNA结合位点以及在C端的一个四聚化区和一个调节区。这种结构保证了p53蛋白发生四聚体化、并作为转录因子调节多种基因的表达,发挥不同生物学作用。

Momand等[11]首先提出了MDM2与p53相互作用,这种假说通过免疫沉淀研究被证实,两者之间相互作用的位点已经被发现。通过p53基因敲除和变体研究,发现MDM2结合在p53蛋白N端转录活性区域。对p53蛋白N端的11个氨基酸和MDM2蛋白N端109个氨基酸片段的复合物进行晶体X线衍射研究,发现MDM2-p53结合界面的表面积为14.98nm2,二者之间主要以疏水作用结合。MDM2疏水裂隙界面上排列有14个芳香性和疏水性氨基酸,p53疏水面与MDM2螺旋结合,另一侧与MDM2折叠接近,使Phe19、Trp23和Leu26嵌入到MDM2疏水裂隙中,结合界面另有两处分子间以氢键相连。

在上述结构基础上,MDM2以两种方式调节p53功能,即介导p53蛋白降解和抑制p53的转录活性。MDM2通过促进p53核输出而促进其降解,使p53在细胞中保持较低水平,或使其处于无活性状态。研究表明,MDM2下调了p53作为抑癌基因的活性,两者之间存在着一个自动调节的负反馈环[12]。生理情况下,MDM2和p53在细胞内的表达维持在一个较低水平,p53-MDM2负反馈环既调节了p53蛋白活性,又调节了MDM2基因表达。

DNA损伤时,细胞内p53水平升高,在G

1

期末限制点阻滞细胞周期进展;与此同时,p53也激活了MDM2基因转录,增强了MDM2蛋白表达。MDM2蛋白特异性地结合到p53上,抑制p53转录功能,促进p53向核外转运,并作为E3泛素连接酶使p53蛋白经泛素化途径降解,使之不可逆地失活。这种双向调节机制维持了细胞对于应激反应的平衡。MDM2过表达可以封闭p53介导的反式激活作用,使p53功能丧失,染色体不稳定性增加、细胞周期进展,显示出癌蛋白的活性,参与肿瘤的形成[13]。

2.2p53非依赖途径除了通过p53依赖的途径外,MDM2还可以与其他蛋白相互作用,以p53非依赖途径发挥作用。如MDM2与p21蛋白、早幼粒细胞白血病(promyelocytic leu-kemia,PML)蛋白和视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,Rb)蛋白等结合,参与调节细胞增殖和凋亡。

p21是p53下游基因,其编码蛋白可以阻滞细胞周期进展和促进凋亡,并增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。MDM2通过180 298位氨基酸与p21中20S蛋白酶体的C8亚基结合,促进蛋白酶体介导的p21降解,并降低p21蛋白的稳定性。如果下调MDM2表达,p21蛋白表达就相应增加,导致细胞周期进展阻滞,提高肿瘤细胞的化学敏感性,这种作用和p53状态无关[14]。

PML蛋白是一个广谱的肿瘤生长抑制因子,能够抑制多种肿瘤细胞和恶性转化细胞的生长。MDM2中心区域可以和PML上300 633位氨基酸残基组成的羧基末端结合,其环指和PML上100 200位氨基酸残基构成的环指结合。MDM2通过抑制PML出核,进而下调PML对GAL4-CBP转录激活作用[15]。另一方面,PML通过与MDM2相互作用,将MDM2定位在核内,干扰MDM2自身泛素化降解,维持MDM2蛋白水平。PML蛋白泛素化修饰能抑制两者之间的相互作用。

Rb蛋白能阻滞细胞周期进展和诱导细胞凋亡。MDM2酸性区域和锌指结构能与磷酸化Rb结合,下调Rb基因的抗增殖活性,发挥生长调节功能[16]。MDM2也可与Rb蛋白相关的E2F1蛋白以及E2F1相关的DP1蛋白结合,通过促进MDM2-E2F1/DP1复合体的形成,上调E2F1相关基因表达,使细胞由G1期进入S期,加快细胞分裂与增殖。

2.3其他机制肿瘤抑制因子PTEN、抑癌蛋白ARF以及乏氧等也参与调节MDM2的活性。PTEN可以通过磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3kinase,PI3K-Akt)依赖及非依赖两种方式抑制MDM2的功能。研究表明,MDM2定位到细胞核才能与p53相互作用。PI3K/Akt信号可以磷酸化MDM2,这对于MDM2从细胞质移位进入细胞核是必需的[17]。PTEN抑制PI3K/Akt信号通路,导致了MDM2在细胞质内聚集,抑制MDM2与p53结合能力。另外,免疫共沉淀分析发现,PTEN可以直接与p53结合,从而消除MDM2抑制p53的功能,PTEN缺失则活化了MDM2介导的抗凋亡作用,引起细胞凋亡的抗拒。

抑癌蛋白ARF是由p16INK4a的替代读码框架编码。它是一种细胞周期抑制因子,通过与MDM2结合抑制MDM2泛素连接酶活性。ARF还能与MDM2和p53形成三聚体,阻止MDM2和p53从核中运出和p53降解,提高p53稳定性。

3MDM2基因与恶性肿瘤

MDM2基因异常与多种恶性肿瘤的发生与发展相关。主要的异常改变包括MDM2启动子区域单核苷酸多态性(SNP)和基因扩增。MDM2启动子区309单核苷酸多态性(309T＞G)增强了SP1转录因子的结合能力,使MDM2的转录增强[18]。在部分肿瘤(如肉瘤和结肠癌)中,MDM2可见基因扩增[19-20]。MDM2基因异常与肿瘤易感性、分期、疗效和预后相关。

3.1非小细胞肺癌(NSCLC)Liu等[4]发现不吸烟或少吸烟人群中,MDM2G/G纯合子变异体增加了NSCLC的易感性,但在中到重度吸烟者中却无此现象。该研究认为不吸烟或很少吸烟者MDM2基因启动区第309位等位基因由T变为G后,增强了与转录激活因子的亲和力,导致MDM2在转录和蛋白水平增高,下调了p53途径的抑癌作用,促进了NSCLC的发生。Dworakowska等[21]采用实时定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测了116例NSCLC肺切除标本中MDM2基因扩增情况,发现21%的病例存在MDM2基因扩增,但MDM2基因扩增与临床病理特征,如性别、分期、组织学分级等因素无相关性,而与患者的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)相关。其中,MDM2基因扩增者中位DFS为3个月,非扩增者达31个月;MDM2基因扩增者中位OS为9

个月,非扩增者长达33个月。说明MDM2基因扩增可作为NSCLC预后不良的指标。该研究者在其后的工作中以免疫组织化学(IHC)法检测了50例NSCLC组织样本,发现MDM2蛋白表达与患者预后不良相关。由此可知,MDM2基因可能参与了NSCLC的发生与发展,该指标有可能作为NSCLC的预后指标。

3.2乳腺癌最近一项研究表明,MDM2基因启动子区域SNP309多态性有助于评估亚洲、非洲女性的乳腺癌患病风险[22]。Krekac等[23]应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和IHC法检测了158例乳腺癌组织中MDM2启动子区域多态性,并分析了多态性与MDM2蛋白表达的关系,结果发现两者之间并无相关性,因此认为MDM2 SNP309多态性并不增加乳腺癌的患病风险。Chrisanthar 等[24]观察了多态性与疗效之间的关系,发现MDM2 SNP309TG/GG基因型合并p53突变的乳腺癌患者,一线使用紫杉醇类疗效不佳。此研究为乳腺癌患者合理地选择一线化疗药物提供了部分依据。

3.3消化系统恶性肿瘤MDM2基因异常参与了消化系统恶性肿瘤的发生和发展,并与预后有关。研究发现MDM2 SNP309G等位基因是一个重要的肝癌患病风险因子[25]。Cescon等[26]对371例食管癌患者进行p53和MDM2多态性联合检测,发现MDM2SNP309G/G基因型可以作为食管鳞状细胞癌的预后不良指标。Hav等[19]应用荧光原位杂交(FISH)和IHC法对80例结肠癌标本进行检测,MDM2基因扩增率为18%,且MDM2基因扩增与蛋白表达之间呈显著相关性,认为MDM2基因可以作为结肠癌靶向治疗的靶点。Sugano等[27]应用实时定量RT-PCR联合FISH方法检测了结直肠癌中MDM2基因扩增,并分析了基因扩增与肿瘤分期的关系,发现Dukes'C期患者的MDM2基因扩增率显著高于Dukes'A、Dukes'B期,但Dukes'D期MDM2基因扩增率反而显著低于Dukes'A、Dukes'B期。

3.4泌尿系统恶性肿瘤Wang等[2]研究发现MDM2启动子区域C1797G多态性与中国人群膀胱癌遗传易感性相关。MDM2C1797G多态性改变了CAAT增强子结合蛋白a(C/ EBP a)与MDM2启动子的亲和力,从而影响MDM2基因功能,由此认为MDM2C1797G多态性可以作为膀胱癌的遗传易感性指标。Haitel等[28]应用IHC法检测了97例肾透明细胞癌样本,MDM2蛋白表达率为19%,其中,低分化组MDM2蛋白表达率显著高于高、中分化组,且MDM2蛋白和突变型p53蛋白同时表达者预后最差,两项指标联合检测可作为肾透明细胞癌的预后指标。

3.5血液系统肿瘤Willander等[29]对210例慢性B细胞性白血病患者进行MDM2SNP309多态性检测,发现MDM2SNP309可以作为慢性B细胞性白血病的独立预后因子。然而,在另一项慢性淋巴细胞性白血病的研究中得到了相反的结果,MDM2 SNP309尚不能作为预后指标[30]。Hendy等[31]对46例儿童急性淋巴细胞白血病患者进行流式细胞术(FCM)检测,MDM2高表达者为32.6%,且MDM2蛋白高表达与患者外周血原始细胞计数以及中枢神经系统浸润有关,认为MDM2蛋白可以作为儿童急性淋巴细胞白血病的预后不良指标。

3.6骨肉瘤Toffoli等[32]对201例骨肉瘤患者进行MDM2 SNP309和p53Arg72Pro多态性联合检测,发现MDM2T309G 多态性显著增加了女性骨肉瘤的患病风险,而p53Arg72Pro 多态性增加骨肉瘤患者的死亡风险,后者可作为骨肉瘤的预后指标。Mejia-Guerrero等[20]应用实时定量RT-PCR方法,检测了130例典型骨肉瘤和15例皮质旁骨肉瘤样本MDM2基因扩增情况,典型骨肉瘤中MDM2基因扩增率为12%,而皮质旁骨肉瘤中MDM2基因扩增率高达67%,经单因素和多因素分析,发现MDM2基因扩增与骨肉瘤患者的年龄、性别及肿瘤亚型有关。

4MDM2的靶向治疗

小鼠模型的遗传学研究表明,p53功能丧失会诱发肿瘤形成,而p53基因功能重新激活则能有效地抑制体内肿瘤发生。MDM2-p53之间的负反馈调节环为恶性肿瘤治疗提供了一个高效的治疗靶点。这方面的治疗手段主要有3种: (1)下调MDM2的表达;(2)抑制MDM2泛素连接酶活性;

(3)阻断p53-MDM2的结合。目前已报道有效的药物大致分为3类:(1)多肽及其类似物;(2)经基因工程技术对野生型p53基因进行修饰,获取不与MDM2蛋白结合的新型p53蛋白;(3)非肽小分子化合物干扰MDM2-p53的相互作用。目前研究较多的药物是咪唑啉类似物Nutlins和色氨酸衍生物NJ-26854165。

4.1咪唑啉类似物Nutlins顺式咪唑啉类似物Nutlins作为MDM2的小分子抑制剂,高度模拟p53肽段的作用,其咪唑啉结构代替了p53肽段主链,精确地占据了MDM2蛋白上p53结合位置,干扰了MDM2-p53之间的相互作用,使p53持续发挥活性,从而阻滞细胞周期进展、促进细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用[33]。体内外研究发现,在野生型p53基因的肿瘤细胞中, Nutlins通过干扰MDM2-p53的相互作用而发挥作用[34-37];而在p53失活的细胞内,Nutlins通过干扰MDM2-p73之间的相互作用,增强p73的转录活性,促进细胞凋亡[38]。

另有研究表明,Nutlins对表达野生型p53蛋白的细胞有放射增敏作用[39]。Nutlins作为放疗增敏剂减少了内皮细胞形成脉管系统的能力,能引起更广泛的细胞周期阻滞和细胞凋亡。此外,Nutlins也可用于克服各种药物化疗引起的耐药性[40]。在肝细胞性肝癌细胞株中,Nutlin-3a联合多柔比星可以显著提高细胞毒作用[41]。在肉瘤细胞株内,Nutlin-3a 可以增强多柔比星、顺铂类药物的细胞毒作用[42]。这些研究提示Nutlins可以作为野生型p53表型的恶性肿瘤的有效治疗药物。

在骨肉瘤的模型鼠中,Nutlins200mg/kg,每日2次,连续给药20天后,肿瘤完全消失。与MDM2的反义寡核苷酸比较,该药的毒性更小[33]。RG7112是Nutlins的一种口服制

剂,在实体瘤和血液系统恶性肿瘤中正在进行Ⅰ期临床试验,初步结果显示,RG7112治疗脂肪肉瘤、急性粒细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病具有一定的疗效,且安全性好,值得进行后续的临床研究[43]。

4.2色氨酸衍生物NJ-26854165NJ-26854165是一种口服的MDM2小分子抑制剂,属于色氨酸衍生物。临床前研究揭示,NJ-26854165与MDM2羧基端RING结构域结合,影响MDM2-p53的相互作用,提高了p53的稳定性并激活p53通路,介导细胞周期阻滞和凋亡[44]。进一步研究还发现NJ-26854165具有p53非依赖的促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤增殖的活性[45]。以上有关NJ-26854165的研究为开展临床试验奠定了基础。

2009年ASCO年会上公布了NJ-26854165的Ⅰ期临床试验结果[46]。在47例入组患者中,从每天4mg到400mg共观察了11个药物剂量梯度的安全性。结果显示,主要的1、2级不良反应包括恶心、呕吐、疲乏、厌食、失眠、电解质紊乱及轻度的肝肾功能损害,没有出现血液学毒性和心脏毒性。严重的不良事件包括1例患者在给药剂量达到每天300mg时出现3级无症状的Q-T间期延长。其后的病例在单次药物剂量达到每天400mg时,有2/3的患者出现3级皮疹以及Q-T间期延长。因此,在扩大的人群中将NJ-26854165单次给药最大耐受剂量确定为每天350mg。为了降低Q-T间期延长的发生,给药方案调整为从每日2次,每次150mg的剂量开始。药物代谢动力学显示,在20mg至400mg之间的单次给药呈线性药代动力学特点。该试验探索了不同给药方案在人体内的耐受性,为后续临床试验确定了剂量水平。

5展望

MDM2在肿瘤的发生和发展中起重要作用,该基因有可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。目前,大多数研究尚处于临床前和Ⅰ期临床试验阶段,如何将这些早期的研究成果转化为临床应用,是未来亟待解决的问题。此外,MDM2在各种恶性肿瘤中表达差异较大,这种异质性会影响此类药物的临床适应证。另外,MDM2作为预后和疗效预测指标的价值有待深入研究。针对MDM2-p53之间的调节环的靶向治疗为恶性肿瘤的治疗策略拓展了新的思路。