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黄芩始载于《神农本草经》，为唇形科多年生草本植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。其味苦、性寒，具有清热燥湿、止血安胎、泻火解毒、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等功效[1]，但其抗炎的作用机制研究较多地停留在整体动物指标层面，应用网络药理学方法的研究较少。与化学药通常作用于单一靶点不同，中医药的治疗作用体现在对复杂疾病的辨证施治，强调整体性，体现了中药多成分-多靶点-多途径作用的理念[2]。但中药复杂的作用机制使得其深入研究存在较大的困难。随着系统生物学的出现，运用网络药理学方法可以建立复杂成分的分子网络与多重靶点、基于靶点蛋白的蛋白质与基因的相互作用关系，以促进活性化合物的研究[3]，为探究活性化合物与其作用靶点之间的相互关系提供更好的方法。本研究旨在寻找黄芩中具有成药性、口服吸收较好的成分，并预测这些成分的抗炎作用靶点及相关信号通路，为黄芩抗炎作用的深入研究提供参考。 1 材料与方法 1.1 黄芩活性成分的搜集与筛选 在中药系统药理学分析平台（TCMSP，http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中输入关键词“黄芩”，得到286种活性成分信息。类药五原则是化合物成药的必需条件[4]，包括相对分子质量＜500、氢键供体数目（Hdon）＜5、氢键受体数目（Hacc）＜10、口服生物利用度（OB）是评价中药临床药效的有效指标。本研究结合“类药五原则”与“OB＞30%”[6]及文献报道[7]筛选出黄芩中可被口服吸收的28种活性成分。 1.2 黄芩活性成分作用靶点的预测与筛选 通过TCMSP数据库和PubChem（https:// Pubchem.Ncbi.nlm.nih.gov）[8]查找并导出28个活性成分的三维化学结构数据，保存为mol2格式。为了预测黄芩潜在的作用靶点，将这28种成分以mol2格式输入PharmMapper（http://lilab./ pharmmapper/index.php）活性成分服务器中执行反向对接[9]。将选择靶点集（select target set）设置为“仅人类蛋白质靶点” [human proteintargets only（v2010，2241）]，其余参数不变。下载每个成分的反向对接预测结果，将对接得分Z值以降序排列，选取每个成分的前50个靶点用于后续研究。 1.3 活性成分-预测靶点网络的构建 将黄芩的活性成分与相关预测靶点导入Cytoscape 3.4.0（http://www./）[10]软件中构建活性成分-靶点网络，以探究黄芩的药理学作用机制。Cytoscape是一个开放源码的生物信息分析软件，其核心架构是网络，每个节点（node）是基因、蛋白质或分子，节点与节点之间的连接（edge）代表这些生物分子之间的相互作用，一个节点的度（degree）值表示网络中节点与节点相连的数目，度值越大，则这个靶点越有可能是化合物的关键作用靶点。 1.4 抗炎相关靶点蛋白的搜集 Therapeutic TargetDatabase（TTD，https://db. idrblab.org/ttd/）可提供已知或正在探索的可用作治疗的蛋白靶点和核苷酸靶点信息，以及与之相对应的疾病、通路和相应的药物/配体信息[11]。以“anti-inflammatory”为关键词进行捜索，收集与抗炎相关的蛋白信息。 1.5 抗炎相关靶点确认与活性成分-抗炎靶点网络的构建 将TTD中得到的靶点输入String10.0[12]中预测靶点与靶点之间的相互作用关系，选取打分值大于0.7作为蛋白之间相互作用的高置信度依据。将结果分别输入Cytoscape 3.4.0中构建抗炎靶点蛋白-蛋白相互作用（protein-proteininteraction，PPI）预测靶点网络与抗炎的PPI网络合并，选取网络中的交集，存在交集的蛋白即黄芩抗炎作用靶点。通过构建的抗炎靶点网络，系统分析黄芩抗炎的靶点。 1.6 KEGG通路富集分析 使用DAVIDv6.8数据库[13]对黄芩抗炎网络中的蛋白进行KEGG生物通路富集分析，并以P＜0.05作为显著功能与通路的临界值。利用Cytoscape 3.4.0构建黄芩抗炎作用活性成分-靶点-通路网络。 2 结果 2.1 黄芩中的口服可吸收活性成分 口服给药是一种方便且普遍的药物投送方式，一些在水中溶解度不高的天然成分经口服摄入之后效果不理想。因此，本研究结合“类药五原则”与“OB＞30%”筛选出黄芩中28个可被吸收的化合物， AlogP、Hdon及Hacc见表1。 2.2 黄芩活性成分-预测靶点网络 黄芩活性成分-预测靶点网络（图1）中共包括312个节点（28个化合物节点与284个靶点节点），组成了1 400条相互作用关系。在黄芩活性成分-预测靶点网络中，靶点的平均度值为8.97，其中有10细胞分裂蛋白激酶6（cell division protein kinase 6）、细胞周期蛋白T1（cyclin-T1）、尿苷一磷酸合酶（uridine 5-monophosphatesynthase）、酪氨酸蛋白激酶HCK（tyrosine-protein kinase HCK）、ADP核糖基化酶2（ADP-ribosylcyclase 2）、NADPH羰基还原酶1（carbonyl reductase [NADPH] 1）、脱氧胞苷激酶（deoxycytidine kinase）、葡萄糖-6-磷酸异构酶（glucose-6-phosphateisomerase）、纤维蛋白原γ链（fibrinogen gamma chain）。 2.3 黄芩抗炎作用相关靶点的确证与化合物-抗炎靶点网络的构建 在TTD中检测到9个与抗炎相关的蛋白（表3），其PPI网络（图2）中，共有6个相互作用靶点，组成6条相互作用关系。 使用Cytoscape 3.4.0 merge功能将活性成分-预测靶点网络与TTD中的抗炎靶点PPI网络融合，取其交集部分（图3），得到黄芩中发挥抗炎作用的化合物有20个，作用靶点有有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK14）、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2（ERBB2）、肿瘤坏死因子受体超家族成员1A（TNFRSF1A）、表皮生长因子受体（EGFR）、E-选择素（SELE）、巨噬细胞移动抑制因子（MIF），其拓扑学性质见表4。其中丹参素、表儿茶素、黄连碱等成分主要作用于MAPK14；红花素等作用于TNFRSF1A；二氢木蝴蝶素A、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄烷酮、黄芩苷等成分主要作用于EGFR。靶点的度值越高，表明活性成分作用于该靶点发挥抗炎作用的几率就越大。 2.4 KEGG通路富集分析及黄芩活性成分-靶点-通路网络的建立 使用DAVID平台进行KEGG通路富集分析，以分析黄芩抗炎活性成分-靶点网络中的6个靶蛋白在信号通路中的作用。结果显示6个靶蛋白涉及21条信号通路，以P＜0.05筛选出11条信号通路（表5）。其中包含炎症信号通路（TNF signaling pathway）、免疫信号通路（hepatitis C、epithelial cell signaling inhelicobacter pylori infection）、癌症信号通路（proteoglycans in cancer、bladder cancer、endometrialcancer、non-small cell lung cancer、central carbon metabolism in cancer、pancreatic cancer）、细胞增殖信号通路（MAPK signaling pathway）。 使用Cytoscape 3.4.0 merge功能将活性成分-抗炎靶点与靶点-通路网络融合（图4），显示了黄芩抗炎活性成分与靶点以及相关作用通路之间的关系。从活性成分-靶点-通路网络中筛选出与炎症反应相关的代谢通路，并构建抗炎相关的活性成分-靶点-通路网络（图5），从图5中可以看出，大多数的抗炎活性成分是通过直接作用于MAPK14靶点发挥抗炎作用。表6显示了这些抗炎活性成分与相关靶点的反向对接得分，这些成分可能是黄芩提取物中发挥抗炎作用的主要成分。
3 讨论 文献报道[14-17]黄芩中的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类化合物具有抗炎活性。本研究结果显示黄芩中的黄连碱、表小檗碱等生物碱及二氢木蝴蝶素、二氢木蝴蝶素、降穿心莲黄酮等成分也显示了抗炎活性。MAPK14、TNFRSF1A、EGFR、SELE等是黄芩抗炎的主要作用靶点，黄芩中的抗炎活性成分可直接作用于MAPK14、EGFR发挥抗炎作用，也可间接作用于其他靶点而发挥抗炎作用（图5）。MAPK14是4个p38 MAPKs之一，p38 MAPKs在由促炎细胞因子或者物理刺激等细胞外刺激所引发的细胞级联反应中起重要作用，能够使广泛的蛋白质磷酸化，这些蛋白质各自可具有200至300个底物。一些促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）是一些炎症病理生理反应最重要的调节因子[18-19]。由p38 MAPKs调节的转录级联会导致IL-β与TNF-α等促炎细胞因子的产生，并导致与炎症反应相关的重要的酶的激活[20]。因此，推测黄芩中的抗炎活性物质通过抑制MAPK14基因使IL-β与TNF-α等促炎细胞因子释放减少，从而发挥抗炎作用[21-22]。EGFR是表皮生长因子（EGF）受体，同时也是TGF-α受体。因此推测黄芩中的活性成分通过与EGFR相互作用而阻断促炎细胞因子与EGFR的结合而发挥抗炎作用。TNFRSF1A是I型TNFR，主要通过活化核转录因子-κB（NF-κB）、诱导细胞凋亡、诱导IL-6释放而介导炎症反应[23]。因此推测黄芩中的抗炎活性成分通过与TNFRSF1A相互作用，减少IL-6等促炎性细胞因子释放，进而发挥抗炎作用。E-选择素是一种细胞表面糖蛋白，能够介导细胞与细胞、细胞与胞外基质相互黏附。E-选择素的表达是启动炎症反应的关键步骤之一[24]。在炎症反应中，白细胞通过与血管内皮细胞的黏附引起血浆外渗，进而造成组织水肿，同时也导致炎症反应。在此过程中，E-选择素介导CD11/CD18复合物与ICAM-1结合形成更紧密的复合物，使白细胞进入血管周围的基质，产生白细胞浸润效应[25]。因此推测黄芩中的活性有成分通过抑制E-选择素的表达而达到抗炎的作用。 炎症反应是一个复杂的过程，涉及到多基因与信号通路。黄芩中的活性成分众多，这使得黄芩抗炎作用机制的研究更加困难。本研究结合“类药五原则”与OB＞30%筛选出黄芩中口服吸收较好的28种成分。结合靶点与通路分析，发现黄芩中可能通过以下3种方式发挥抗炎作用：减少促炎细胞因子的产生、阻断促炎因子与相应受体的结合、抑制启动炎症反应的关键蛋白的表达。 本实验首次运用网络药理学的方法报道黄芩的抗炎作用机制，成功地预测了黄芩抗炎作用主要作用的靶点与相关的信号通路，发现黄芩通过多成分作用于多靶点发挥抗炎作用，但研究结果仍需要通过进一步的实验加以证明。 参考文献（略） |
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