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自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一种以肝实质损害为特征的炎症性疾病，在亚太地区的发病率约为0.005%～0.025%，且呈逐年上升趋势[1]，如果不及时治疗，则会迅速发展为肝硬化和肝衰竭，严重危害人类健康。AIH的发病原因较为复杂，临床上多以糖皮质类激素如地塞米松磷酸钠注射液等进行治疗，但极易引起机体诸多不良反应[2]。因此，研究安全、有效和经济的治疗药物仍然是治疗AIH的临床需要。 荆防颗粒组方来源于明代张时彻《摄生众妙方》中的荆防败毒散，由荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗、甘草11味中药组成，具有畅达气机，扶助正气，消除风寒、湿热、痰瘀、气滞的作用，广泛用于多种系统疾病的治疗[3-4]。现代药理学研究表明，荆防颗粒具有良好的抗炎作用，可增强机体免疫力，保护肝脏的免疫功能[5-8]。 网络药理学作为药物研究的新模式，通过构建成分-靶点-疾病等相互作用网络，对中药复方物质基础和作用机制研究提供新的方法[9-10]。本课题组前期研究表明，荆防颗粒对刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）诱导的免疫性肝炎具有显著的保护作用，但其作用机制尚不清楚。因此，本研究旨在从网络药理学的角度预测荆防颗粒治疗AIH的成分、靶点和信号通路，结合实验验证深入探究荆防颗粒对AIH的治疗作用及作用机制，为临床上应用荆防颗粒治疗AIH提供理论依据。 1 荆防颗粒活性成分与靶点的筛选通过TCMSP数据库检索荆防颗粒中的11味药中所有的潜在靶点，以同时满足OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，再通过UniProt数据库更正和删除重复项目后，共鉴定出269个与荆防颗粒相关的非重复性靶点和159个活性成分。将信息导入Cytoscape软件分析荆防颗粒“中药-成分-靶点”网络，度值排名前10位的活性成分见表1。  2 荆防颗粒治疗AIH的关键靶点网络构建通过Genecard、OMIM和Drugbank数据库共获得761个AIH疾病相关靶点，汇总去重后，共获得343个非重复性靶点。将269个荆防颗粒靶基因与343个潜在AIH相关靶基因取交集，共获得25个交集靶点（图1-A），为荆防颗粒治疗AIH的潜在靶点。应用Cytoscape软件对荆防颗粒治疗AIH的25个潜在靶点构建成分-疾病靶点网络，见图1-B。将潜在靶点导入STRING数据库得到PPI网络，进一步分析获得其核心网络，并通过Cytoscape软件可视化，见图1-C。拓扑分析前10名的核心网络靶点包括IL-6、TNF-α、IL-1β、STAT3、CXCL8、IL-10、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、Caspase-8（CASP8）和C反应蛋白（C-reaction protein，CRP）。  3 GO功能和KEGG通路富集分析GO功能富集分析主要包括生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。将25个潜在治疗靶点导入Metascape数据库后，得到GO条目689个（P＜0.01），生成了BP、MF、CC和KEGG富集分析结果。其中BP条目共646个，主要涉及细胞因子的产生、炎症反应、凋亡信号通路和免疫过程；MF条目34个，主要参与细胞因子受体结合，包括肿瘤坏死因子受体结合；CC条目9个，主要涉及质膜和囊泡（图2）。KEGG通路富集分析筛选得到93条通路（P＜0.01），结果表明，荆防颗粒可能通过调节炎症反应、细胞因子、肝细胞坏死等信号通路治疗AIH（图3）。   4 荆防颗粒对AIH模型小鼠的保护作用通过建立Con A诱导的AIH小鼠模型，验证网络药理学分析的结果。如图4-A所示，模型组小鼠死亡率远高于对照组，而各给药组小鼠死亡率均低于模型组，且荆防颗粒中、高剂量组小鼠死亡率低于地塞米松组。如图4-B、C所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST活性均显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，荆防颗粒中、高剂量组和地塞米松组血清中ALT和AST活性均显著降低（P＜0.05、0.01）。如图4-D所示，模型组小鼠肝组织出现明显的门脉炎症，中央静脉周围出现严重的窦性充血以及点状或斑片状坏死；给予荆防颗粒或地塞米松磷酸钠注射液治疗后，小鼠肝脏中的炎症细胞浸润和细胞坏死受到显著抑制（P＜0.05、0.01）。以上结果表明，荆防颗粒可以减轻Con A诱导的AIH小鼠的肝损伤，且药效优于地塞米松磷酸钠注射液。  5 荆防颗粒对AIH小鼠肝组织炎症因子水平的影响网络药理学结果和KEGG通路富集分析表明，大多数确定的关键靶点在炎症细胞因子的相互作用中富集。通过ELISA试剂盒检测肝组织中相关炎症因子水平，如图5所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL8水平均显著升高（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，荆防颗粒高剂量组TNF-α水平显著降低（P＜0.05），荆防颗粒中、高剂量组和地塞米松组IL-1β水平显著降低（P＜0.05），荆防颗粒高剂量组和地塞米松组IL-6水平显著降低（P＜0.05），荆防颗粒中、高剂量组CXCL8水平显著降低（P＜0.05），表明荆防颗粒对Con A诱导的AIH小鼠具有显著的抗炎作用。基于上述结果，选择荆防颗粒高剂量（8 g/kg）组作为代表组，探讨荆防颗粒治疗AIH的作用机制。  6 荆防颗粒对AIH小鼠肝组织IL-6/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响如图6所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和Bax蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，荆防颗粒高剂量组小鼠肝组织中IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3和Bax蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。  7 荆防颗粒对AIH小鼠肝组织NLRP3/IL-1β信号通路相关蛋白表达的影响如图7所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1和下游IL-1β蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01），表明模型组小鼠具有明显的炎症反应；与模型组比较，荆防颗粒高剂量组NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1和下游IL-1β蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。  8 荆防颗粒对AIH小鼠肝组织TNF-α/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响如图8所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中TNF-α和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，荆防颗粒高剂量组TNF-α和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01），表明荆防颗粒能够抑制TNF-α/NF-κB信号通路相关蛋白的磷酸化水平。  讨论AIH是一种典型的自身免疫性疾病，发生于任何年龄和种族[12-13]。几十年来对治疗AIH药物的研究表明，单一靶点药物难以解决所有问题[14]。近年来，中医药治疗AIH因其药理作用明显、不良反应少而受到越来越多的关注[15]。荆防颗粒具有改善能量代谢循环、解表驱汗、抗炎等作用[3-5,8,16]。研究表明，荆防颗粒通过降低促炎因子表达、抗氧化、调节转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad4信号通路对CCl4诱导的小鼠肝纤维化有明显的治疗作用[17]。此外，荆防颗粒还可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路发挥解酒保肝作用[18]。 网络药理学综合了中药有效成分、相应靶点和相应疾病3个方面，并将其作为3种不同类型的节点，形成“成分-靶点-疾病”网络，揭示了中药治疗相关疾病的有效成分和作用机制[9]。李志杰等[19]通过网络药理学探究了苦黄颗粒治疗AIH的活性成分和作用机制。郝建亨等[20]通过网络药理学技术探究了丹参酮IIA治疗AIH的潜在靶点与通路之间的关系。本研究通过网络药理学和实验验证探究荆防颗粒治疗AIH的作用机制，确定了槲皮素是荆防颗粒最重要的活性成分，其次是木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚和汉黄芩素等。通过Venn图确定荆防颗粒与AIH疾病相关的25个中心靶点。成分-靶点网络表明，荆防颗粒在AIH治疗中作用于多个靶点并产生协同效应。 GO功能和KEGG通路分析表明，大多数靶点在炎症和凋亡过程中富集。网络药理学分析未提供特定的信号通路靶点，但本研究从荆防颗粒治疗AIH相关的交叉靶点中发现了炎症和凋亡通路。PPI网络显示IL-6、TNF-α、IL-1β、STAT3和CXCL8是5个度值最大的靶点，这些靶点都表明了荆防颗粒对AIH的抗炎和抗凋亡特性，实际可能存在涉及更有效成分和作用机制的暗示。 Con A诱导的AIH模型是一种具有代表性的、易于构建的AIH模拟模型，也是一种急性肝损伤模型，可导致高死亡率[21]。此外，Con A诱导的AIH模型的典型特征为炎症细胞因子的分泌，ALT和AST活性升高，肝细胞凋亡和坏死异常[22]。本研究结果表明，荆防颗粒能显著降低Con A诱导的AIH模型小鼠的死亡率、肝组织炎症和细胞凋亡，并能抑制AIH小鼠血清ALT和AST的活性。 异常的IL-6/STAT3信号通路在AIH的发生和发展中起着关键作用，抑制IL-6/SATA3信号通路可以减轻Con A诱导的肝损伤[23]。在自身免疫炎症性疾病模型中，分泌的IL-6通过gp130与受体结合，激活JAK2并触发STAT3通路，调节肝细胞凋亡[24]。Bcl-2表达提高有利于增强细胞的抗凋亡功能，而Bax的增加则促进细胞凋亡。Bax/Bcl-2值通常用来表示细胞凋亡水平[25-26]。 李翔子等[27]研究结果证实，荆防颗粒可以通过抑制JAK2/STAT3通路调节T淋巴细胞亚群的平衡，在荨麻疹动物模型中发挥抗炎作用，从而保护小鼠免受自身免疫性疾病。曹天佑等[28]研究证实，荆防颗粒可显著抑制由炎症导致的细胞凋亡。IL-1β在多种自身炎症性疾病中发挥重要的作用，IL-1β能够通过支持T细胞存活、上调淋巴细胞上的IL-2受体、促进B细胞增殖和Th17细胞分化来介导炎症反应[29]。NLRP3是先天免疫的重要组成部分，由NLRP3、ASC和Caspase-1组成，用于诱导IL-1β的释放，在AIH肝脏炎症中起关键作用[30]。 此外，IL-1β能与IL-6和TNF-α产生协同作用，参与炎症细胞的释放和炎症通路的激活。TNF-α是一种炎症细胞因子，可以激活固有免疫途径并触发炎症反应[31]。TNF-α通过介导NF-κB的激活来刺激细胞因子的产生，并增强AIH的炎症反应[32]。NF-κB是一种主要转录因子，介导Con A诱导的免疫炎症反应，并参与TNF-α诱导的不同类型细胞中炎症蛋白的表达[33]。 El-Agamy等[34]阐明了NF-κB在Con A诱导的AIH发病机制中的作用，Con A刺激NF-κB的磷酸化并启动和调节炎症过程，促进炎症细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的产生。本研究结果表明，荆防颗粒显著抑制了AIH模型小鼠肝组织中STAT3、NLRP3和NF-κB信号通路相关蛋白的表达。荆防颗粒可能通过抑制STAT3、NLRP3和NF-κB信号通路的激活，在细胞凋亡和炎症水平上对AIH产生抑制作用。因此，STAT3、NLRP3和NF-κB信号通路是荆防颗粒治疗AIH的关键靶点。 AIH早期发病原因主要为CD4+细胞活化和释放IL-1β、IL-6、CXCL8、TNF-α等多种细胞因子[35-37]。这些细胞因子在AIH中被诱导，并导致相关的有害免疫反应[38]。而Con A诱导的AIH炎症反应主要由TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL8的增加介导[36-37,39-40]。ELISA和Western blotting结果表明，荆防颗粒显著抑制STAT3、NLRP3和NF-κB信号通路相关蛋白（IL-6、p-JAK2、p-STAT3、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、p-NF-κB p65）的表达，以上蛋白被激活后反过来刺激并调节炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL8的分泌。 本研究基于网络药理学和AIH小鼠模型，探究了荆防颗粒抗炎作用机制。荆防颗粒通过多成分、多靶点、多通路的协同作用发挥抗炎、抗凋亡作用治疗AIH，证实了网络药理学预测的结果，为荆防颗粒治疗AIH提供依据。 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来 源：张永康，孙成宏，王西双，姚景春，张贵民．基于网络药理学和实验验证探讨荆防颗粒对自身免疫性肝炎小鼠的治疗作用及作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(5):1461-1470. |
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