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气滞胃痛颗粒是《中国药典》收载的非处方中成药，处方来源于医圣张仲景《伤寒论》中经典方四逆散，由柴胡、白芍、枳壳、香附（炙）、延胡索（炙）、甘草（炙）6味药材组成，具有舒肝理气、和胃止痛的功效[1]。此药临床广泛用于治疗肝郁气滞、胸痞胀满、胃脘疼痛，疗效确切，有抗炎镇痛、抗溃疡、促胃动力等作用[2-4]。本方即四逆散加延胡索、香附和血理气，治疗胁痛，寒热往来，专以疏肝为目的。用柴胡、枳壳、香附理气为主，白芍、延胡索和血为佐，再用甘草以缓之，调和诸药。现代药理研究表明，柴胡具有显著的抗炎镇痛作用，且可以保护消化系统，提高机体免疫力；白芍可以抗炎镇痛，治疗包括便秘、腹泻、腹胀、阴寒、脾虚等肠道应激性综合征，增强免疫功能；香附具有抗炎镇痛、抗氧化的作用，对胃黏膜具有保护作用；延胡索可以改善心血管疾病，具有抗实验性胃溃疡作用，抑制胃酸分泌，也具有抗炎镇痛的药理作用；枳壳具有调节胃肠运动，治疗胃肠道疾病的作用，同时还可以治疗胃下垂和功能性消化不良；甘草也具免疫调节、抗炎镇痛、解痉等功效[5-10]。复方气滞胃痛颗粒具有明显的胃黏膜保护及促进胃肠蠕动作用，具有明显的抗溃疡、抗炎镇痛作用[2-4]。通过比较发现6味中药既有相同的药理作用，但是也各有侧重，而中药复方防治疾病的物质基础是中药相互协调，相互作用，从而达到整体作用。 近年来，网络药理学的快速发展及其在中医药研究中的拓展应用，为系统研究中药的药效作用机制提供了快捷高效的新手段和新思路。网络药理学的方法，基于系统生物学理论，从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发，通过采用复杂生物网络模型，揭示药物、基因、靶点、疾病之间复杂的整体生物网络关系，在此基础上分析、预测药物的药理学机制[11-14]。而中药及中药复方具有多成分、多途径、多靶点、协同作用的特点[15]，均关注的是整体性而非局部性，都注重的是致病因素或者药物干预下机体或网络系统表现出的整体反应，而不单纯是观察某些局部的器官或病灶[16]。可以说，网络药理学和中医药之间在整体性和系统性方面具有高度的一致性。这也为中药复方的深入研究提供了新的机遇，运用网络与系统的思想来理解复方和生物系统的复杂性，使得现代复方研究由描述转为预测成为可能[17]。 本研究主要是基于文献检索和数据库查询方式收集气滞胃痛颗粒中各药味所含的化学成分和作用靶标，并借助LC-MS技术对化学成分进行指认，利用蛋白质相互作用信息建立药物靶标与炎症疼痛靶标的关联，构建“药物-靶标-疾病”网络，对气滞胃痛颗粒抗炎镇痛作用的主要靶点和作用通路进行分析，并进一步分析复方方解和现代药理学研究及临床运用的关联，以期对指导气滞胃痛颗粒实验研究、临床合理用药以及为中药方剂的网络药理学进一步研究提供参考。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 安捷伦6550 iFunnel Q-TOF LC-MS（美国安捷伦科技公司）；Agilent 1290 超高效液相色谱仪；SynergyH2全功能微孔板检测仪（美国BioTek公司）；万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；台式高速离心机（美国Thermo公司）；微量移液器、多道移液器（德国Eppendorf公司）；DK-600S三用恒温水箱（上海精宏实验设备有限公司）；Vortex-Genie® 2涡旋仪（深圳市安必胜科技有限公司）；离心管（美国康宁公司）；XS-205（COX-2）抑制剂筛选试剂盒（批号180227）购于上海碧云天有限公司；气滞胃痛颗粒（批号20180809）由华润三九医药股份有限公司提供；芍药苷（批号110736-201842，质量分数97.4%，由中国食品药品检定研究院提供）；盐酸小檗碱（批号141128，质量分数98.0%）、槲皮素（批号150914，质量分数98.0%）、黄芩素（批号150320，质量分数98.0%）、黄芩苷（批号151119，质量分数98.0%）由成都普菲德生物科技有限公司提供。 1.2 样品制备和LC/MS条件 取气滞胃痛颗粒适量，研细，取样2.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品。 生物流体的代谢分析在Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS上进行。样品序列是随机的，每个样品的4 μL等分试样注射到ZORBOXRRHD C18分析柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Agilent Technologies公司）上，柱温保持在30 ℃。对于ESI+分析，用25 min线性梯度实现分离，其中流动相为溶剂A（含0.1%甲酸的水）和溶剂B（含0.1% 对于质谱，使用具有正、负离子模式的电喷雾电离源（ESI）的Agilent 6550Q-TOF/MS。电喷雾源参数：电喷雾毛细管电压在负电离模式下为3.5 kV，在正电离模式下为4 kV。质量范围设定为m/z80～1 000。负电离模式下气体温度为225 ℃，正电离模式下气体温度为225 ℃。气体体积流量为13 L/min。雾化器压力为137.90 kPa（负离子和正离。 1.3 数据库及软件 中药系统药理学分析数据库TCMSP[18]（http://lsp./tcmsp.php），TCM-Datebase@ Taiwan数据库（http://tcm.），PubChen Compound数据库（http://www.ncbi.nlm./ pccompound），人类孟德尔遗传数据库OMIM（http://www./），蛋白质相互作用信息数据库DIP[19]（http://dip.doe-mbi./dip/Main.cgi），蛋白质数据库UniProt（http://www./），DisGeNET数据库（http://www./ web/disGeNET/menu），网络可视化及分析软件Cytoscape（Version 3.5.1）。 1.4 靶点数据集的建立 通过中药系统生物学分析数据库TCMSP，并结合文献获得气滞胃痛颗粒中6味中药所含化学成分的结构及其作用靶点信息，并进一步根据口服生物利用度（OB）和类药性（DL）筛选活性成分，OB和DL是中药成分ADME的关键参数。因此利用TCMSP数据平台，计算ADME/T值，对OB、DL进行评估，选取数据库中同时满足OB≥30%和DL≥0.18的化学成分以及文献报道的有活性的化合物作为候选活性成分，建立气滞胃痛颗粒的药物成分靶点数据集，并对数据集的化学成分进行进一步分析，借助LC-MS技术开展气滞胃痛颗粒的全化学成分细致分析进而用这些成分开展作用靶点的预测；通过人类孟德尔遗传数据库（OMIM）中输入关键词inflammation、inflammatory和pain，搜索已报道的和炎症疼痛相关的基因，去除重复基因和假阳性基因，筛选和炎症疼痛相关的基因和蛋白靶点，建立炎症疼痛靶点数据集；蛋白质的相互作用信息来源于蛋白质相互作用数据库（DIP，http://dip.doe-mbi.）。为了便于统一分析，以上所有靶点均转化成UniProt ID格式。 1.5 网络的构建与分析 以蛋白质相互作用信息为纽带，将气滞胃痛颗粒的活性成分、成分对应的靶点、炎症疼痛对应的靶点和交互蛋白对应的靶点进行关联。将上述预测的结果输入Excel表格并导入Cytoscape（3.5.1）软件，采用Cytoscape软件的Merge功能将活性成分与潜在靶点构建“药物-靶点-疾病”网络。网络中，节点（node）分别代表气滞胃痛颗粒的单味药、活性成分、作用靶点、交互蛋白。若某活性成分属于某单味时，则将单味药与活性成分以边（edge）相连；若某一靶点为某单味药或活性成分的潜在靶点时，则以边相连，以此来体现气滞胃痛颗粒多成分、多靶点的作用特点。利用软件将以上网络进行可视化分析，并通过Network Analyzer工具对网络中疾病靶标进行拓扑参数分析，并针对炎症疼痛靶标中度值（degree）大于中位数2倍的靶标筛选气滞胃痛颗粒的主要抗炎镇痛靶标，其中选择中介中心性（betweennesscentrality，BC）和接近中心性（closeness centrality，CC）均大于中位数的节点蛋白作为气滞胃痛颗粒治疗炎症疼痛的关键靶点。针对上述构建的“药物-靶点-疾病”网络进行简化，提取气滞胃痛颗粒中6味中药药物与其抗炎镇痛的42个主要作用靶点和20个直接作用靶点分别构建相互作用关系的网络图。 1.6 生物过程和通路分析 将气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的直接作用靶标导入DAVID数据库，SelectIdentifier设置为OfficialGene Symbol，List Type设置为Gene List，限定物种为人，对气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的直接作用靶标进行GO富集分析和KEGG通路富集。其中GO富集包括生物过程（biological process），分子功能（molecular function）和细胞组分（cellular component）3个部分，设定阈值P＜0.01且FDR＜0.01，并按照涉及的靶点数目简单排序，筛选排名靠前的生物过程或通路。 1.7 作用靶点类型归属 DisGeNET数据库是包含与人类疾病相关的基因和变体的平台之一。在基因和疾病关系中，该数据库一方面可以输入疾病获取与该疾病相关的基因信息，另一方面还可以输入基因获取与该基因相关的疾病信息。在DisGeNET数据库选用基因进行检索，将上述气滞胃痛颗粒的主要作用靶标的UniProt ID依次导入数据库中，获取靶点类型信息（protein class）。 1.8 体外活性验证 精密称取气滞胃痛颗粒和槲皮素、小檗碱、芍药苷单体适量，加DMSO溶解配成1 mg/mL的母液，超声处理30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液过膜备用，使用时将一定量母液加入DMSO制成所需浓度溶液，即得供试品。 采用COX-2抑制剂筛选试剂盒对气滞胃痛颗粒的治疗胃炎作用进行体外实验验证，设置对照孔（底物、探针和缓存液）、100%酶活性对照孔（酶、底物、探针和缓存液）和受试样品孔（酶、底物、探针、缓存液和样品），每组不少于3个复孔，受试样品孔分别加入气滞胃痛颗粒样品或单体化合物，混匀于37 ℃孵育10 min后，使用酶标仪进行荧光检测，激发波长560 nm，发射波长590 nm。计算样品孔和对照孔的平均相对荧光值（relativefluorescence unit，RFU），并计算每个样品的抑制率。 抑制率＝(RFU100%酶活性对照－RFU样品)/(RFU100%酶活性对照－RFU对照) 2 结果与分析 2.1 气滞胃痛颗粒成分分析及抗炎镇痛的成分-靶点-疾病网络构建 通过LC/MS得到气滞胃痛颗粒的总离子流图见图1，通过保留时间、质谱裂解规律、文献信息共鉴定了147个化合物，结果见表1。根据气滞胃痛颗粒所含化学成分与其作用靶标的对应关系以及DIP数据库中的蛋白质相互作用信息，将搜集到化合物成分、药物作用靶标和疾病靶标进行关联，构建气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的成分-靶点-疾病网络。基于上述网络构建方法，共筛选出气滞胃痛颗粒中的化学成分147个，其中柴胡14个、延胡索（炙）42个、枳壳6个、香附（炙）17个、白芍9个、炙甘草75个，其中超过2个药材共有的成分6个。成分作用的靶点蛋白330个以及炎症疼痛相关疾病靶点184个，并依托相互作用蛋白质数据库构建生物靶标网络，利用Cytoscape 3.5.1软件将以上网络进行可视化分析，结果见图2。其中，红色三角形代表气滞胃痛颗粒中的化学成分；蓝色圆点代表气滞胃痛颗粒成分作用靶标；黄色圆点代表气滞胃痛颗粒间接作用的炎症疼痛靶点；黄色正方形代表气滞胃痛颗粒直接作用的炎症疼痛靶点；紫色圆点代表与靶点蛋白存在相互作用的蛋白；棕色六边形代表单味中药。从图2中可以看出同一靶点可对应于不同的活性成分，也可以对应相同的活性成分，充分体现了复方多成分、多靶点的作用特点。 2.2 气滞胃痛颗粒治疗炎症疼痛的网络拓扑参数分析及靶标筛选 利用Cytoscape 3.5.1软件将以上网络进行可视化分析，并通过Network Analyzer工具对网络中疾病靶标的degree、BC和CC 3个拓扑参数进行评估和筛选，筛选结果作为气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的主要作用靶点。根据网络分析结果，筛选参数确定为CC≥0.222 1，degree≥3，BC≥0.001 5，最终筛选出满足条件的靶点44个，见表2。其中，药物的直接作用靶点20个（directed＝1），药物间接作用靶点24个（directed＝0）。 2.3 气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的药物-靶点网络构建 针对上述构建的“药物-靶点-疾病”网络进行简化，提取气滞胃痛颗粒中6味中药药物与其抗炎镇痛20个直接作用靶点分别构建相互作用关系的网络图，结果见图3，这20个炎症疼痛相关靶点在每味中药中分布如下：柴胡中炎症作用相关靶点17个；香附中炎症作用相关靶点18个；白芍中炎症作用相关靶点13个；延胡索中炎症作用相关靶点19个；枳壳中炎症作用相关靶点10个；甘草中炎症作用相关靶点19个。气滞胃痛颗粒中6味药材均可作用于P35354（COX-2），P37231（PPARG），P23219（COX-1），Q16539（MAPK14），P00734（F2），P04150（KDR），P05412（JUN），P07477（PRSS1）等8个炎症疼痛靶点。 2.4 气滞胃痛颗粒抗炎镇痛直接作用靶标的GO富集分析 采用DAVID软件对气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的直接作用靶标进行GO富集分析，包括生物过程（biologicalprocess）、分子功能（MolecularFunction）和细胞组分（cellularcomponent）3个部分，其中，筛选P＜0.01、FDR＜0.01的结果见表3。结果表明，从生物过程的富集结果来讲，气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的靶标主要参与RNA聚合酶II启动子的转录、细胞对脂多糖的响应、ERK1和ERK2级联反应、NO生物合成、炎症疼痛反应、凋亡、平滑肌增殖、DNA转录、血管增生、氧化应激等过程的调节；从分子功能富集结果来说，气滞胃痛颗粒抗炎镇痛作用主要体现为与酶、相同蛋白、转录调控区DNA结合和受体信号蛋白酶活性激活等方面；从细胞组分的富集结果来说，气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的靶标主要集中于膜筏。 2.5 气滞胃痛颗粒抗炎镇痛直接作用靶标的通路富集分析 采用DAVID软件对气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的直接作用靶标进行通路富集分析，选择KEGG数据库作为分类依据，筛选P＜0.01、FDR＜0.01的结果见表4。从表中可以看出气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的主要作用过程包括对TNF信号通路、NOD样受体信号通路、VEGF信号通路等与炎症疼痛密切相关的信号通路。 2.6 作用靶点类型归属 将气滞胃痛颗粒的44个作用靶点依次导入DisGeNET数据库，获取靶点对应的蛋白质类型，见表5。结果表明气滞胃痛颗粒升高白细胞过程中有信号分子、酶调节剂、转录因子、受体、蛋白（连接蛋白、防御/免疫蛋白、贮藏蛋白、转运蛋白、载体蛋白等）、酶（氧化还原酶、丙酮酸激酶、水解酶、异构酶等）等物质的参与。 2.7 体外验证试验 抑制效果。并选取单体化合物槲皮素、小檗碱和芍药苷为例研究单体对COX-2的抑制效果。结果如图4所示，该结果显示，气滞胃痛颗粒和3个单体化合物对COX-2酶活力都具有显著的抑制作用，且在不同浓度范围之内具有明显剂量依赖关系，但半数抑制浓度（IC50）不同，气滞胃痛颗粒IC50为7 μg/mL，槲皮素IC50为1 μg/mL，小檗碱IC50为6 μg/mL，芍药苷IC50为50 μg/mL。
3 讨论 气滞胃痛颗粒临床广泛用于治疗中医学和西医学胃痛。胃病是我国常见的胃肠道疾病，由于社会竞争及饮食结构的变化和影响，当今社会胃病在人群中发病率高达80%。胃痛又称之为胃脘痛，是以胃脘部或近心窝处出现疼痛为主症的病证。由于肝郁气滞引起的胸痞胀满、胃脘疼痛属于中医学胃痛范畴；急性胃炎、慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、功能性消化不良、胃黏膜脱垂等病以上腹部疼痛为主要症状者，属于西医学胃痛范畴。对于慢性胃炎和胃神经官能症方面西医没有特别行之有效的方法，而中医在治疗胃痛方面具有临床症状改善明显，疗效肯定的优势。炎症疼痛[20]是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的复杂防御反应，机体许多成分参与炎症疼痛反应过程，主要包括白细胞、血浆蛋白、血管壁细胞、结缔组织细胞、细胞外基质和炎症疼痛介质等。气滞胃痛颗粒临床上主要用于治疗慢性胃炎和胃溃疡的病理性炎性疼痛，说明其既能抑制外周神经末梢传导而减轻疼痛，又能抑制继发的炎性反应所导致的炎性疼痛，临床应用非常广泛。 气滞胃痛颗粒以疏肝为正法，通过君臣佐使配伍关系达到疗效。本方在四逆散的基础上加延胡索、香附和血理气，治疗胁痛，寒热往来，专以疏肝为目的。用柴胡、枳壳、香附理气为主，白芍、延胡索和血为佐，再用甘草以缓之，系疏肝的正法。方中柴胡入肝胆经，升发阳气，疏肝解郁，透邪外出，为君药。白芍敛阴，养血柔肝，为臣药，与柴胡合用，以补养肝血，条达肝气，可使柴胡升散而无耗伤阴血之弊。香附，疏肝解郁，行气止痛，与柴胡配伍，增强其理气之效。佐以枳壳理气解郁，泄热破结，与柴胡为伍，一升一降，增舒畅气之功，并奏升清降浊之效；与白芍相配，又能理气和血，使气血调和。延胡索活血行气止痛，与香附配伍，增加其行气止痛功效。甘草调和诸药，益脾和中；与白芍配伍，则酸甘化阴，缓急止痛，为佐使药。四药配伍，共奏透邪解郁、疏肝理脾之效，调和肝脾。 利用网络药理学方法从整体上构建气滞胃痛颗粒抗炎镇痛的药物-疾病-靶点网络，结合中药配伍理论分析的结果，可以发现气滞胃痛颗粒的抗炎镇痛作用机制并非单一针对某条通路或某个作用靶点进行调控，而是可能通过多靶点复杂通路的共同干预起效，体现了诸药配伍，协同增效的理论。气滞胃痛颗粒147个化学成分，交互作用于疼痛相关的靶点184个、直接靶点20个，作用机制主要与TNF信号通路、NOD样受体信号通路、VEGF信号通路等16个通路有关。根据作用的靶点进一步分析气滞胃痛颗粒全方药物组成，发现方中iNOS、PPARG、F2、PRSS1、MAPK14、PTGS1、JUN、KDR，COX-1、PPARG等靶点与促进血小板的活化和聚集，血管收缩和平滑肌细胞的增殖有关，体现在柴胡、香附和枳壳解痉止痛的作用，也与白芍和延胡索的活血作用相呼应。MAPK14、F2等靶点在机体免疫过程中发挥保护作用，体现在白芍和甘草增强免疫调和诸药的作用。因此，通过网络药理学的分析，可以进一步分析气滞胃痛颗粒的现代医学内涵，并能够进一步解析中医配伍理论的精髓。 环加氧酶（COX）是花生四烯酸代谢途径的重要作用酶，其可以催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质。目前发现COX有2种COX-1和COX-2同工酶。COX-2是一种膜结合蛋白[21]。研究证实，COX-2一般在正常组织较少表达，它主要在单核细胞、血管内皮细胞、滑膜成纤维细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等一些与炎症有密切关系的细胞或组织上表达[22]。生理状态下绝大部分组织细胞不表达COX-2；而在一些疾病状态下，如炎症、肿瘤等受外来病原体刺激、破坏诱导后，COX-2参与和加重炎症反应，且其表达水平与炎症的严重程度相关，参与多种病理生理过程[23-24]。临床及实验研究已证明COX-2及相关信号通路在胃部疾病的发生、发展过程中扮演重要角色[25]。而且胃黏膜COX-2的表达水平影响胃炎和胃癌变化[26]。因此，COX-2可能是气滞胃痛颗粒治疗炎症/疼痛的重要靶标之一。 本研究针对上述分析中部分单体成分以及成药对COX-2的抑制活性开展了进一步分析，根据文献报道槲皮素、小檗碱、芍药苷3种化合物对COX-2的表达均有显著影响[27-29]，而单体化合物的体外试验亦证实3种单体确实对COX-2有抑制作用，且具有较为明显的剂量依赖关系，且从IC50来看，上述单体成分及成药抑制COX-2效果表现为槲皮素＞小檗碱＞气滞胃痛颗粒＞芍药苷，其中，《中国药典》检测成分芍药苷活性显著低于其他2个成分及全方，提示目前药典检测的指标性成分对于表征成药的整体生物活性代表性不足，建议应适当增加其他高活性成分作为检测指标，或采用指纹图谱、化学特征图谱的方式进行整体控制。 本研究本研究从网络药理学角度说明气滞胃痛颗粒前期相关研究的结果具有可靠性，但由于单纯从数据角度分析，也存在一定的不足，对于气滞胃痛颗粒的抗炎镇痛作用机制还需后期实验研究的进一步验证，从而更加系统科学地阐述气滞胃痛颗粒的抗炎镇痛作用机制。 参考文献（略） 来 源：杨晓娟，胡黄婉茵，张海珠，郝俊杰，刘 靖，刘晓熠，王 玄，邬国松，肖小河，牛 明，罗光明. 基于网络药理学的气滞胃痛颗粒抗炎镇痛活性作用分析 [J]. 中草药, 2019, 50(13):3094-3106.
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