Plus深读 | 甲基转移酶Clr4自身能够甲基化，影响催化活性、维持表观修饰的稳定

原文链接：

https://www./articles/s41586-018-0398-2

前言

H3K9甲基化能够维持基因组稳定性，调控转录尤其是介导异染色质的基因沉默。组蛋白上H3K9me的修饰还存在正反馈机制，即已经被甲基化了的区域会进一步招募甲基转移酶进一步修饰周边区域。这种正反馈调节非常精准，由甲基化酶和去甲基化酶互相平衡，从而防止产生有害的过度甲基化。酵母中的H3K9甲基转移酶Clr4可以起到这种“限制性催化”的作用，防止异常异染色质过度形成。通过X射线衍射解析晶体结构发现，Clr4中存在一个AI loop，可以阻止与底物H3K9的结合；Clr4又能够催化自身这个loop上赖氨酸的甲基化改变构象，从而重新获得催化活性。

1：Clr4可以自甲基化和自抑制

首先研究者发现Clr4能够自我甲基化（Fig.1a-b），并且被甲基化以后催化组蛋白H3甲基化的能力会增强（Fig.1c）。Clr4自身甲基化位点是在Clr4上的几个赖氨酸残基中的K455位（Fig.1d-f）。根据Figure 1d和g的Clr4结构，发现K455位于Clr4具有催化功能的SET结构域和能够结合底物SAH的Post-SET结构域与之间。更有趣的是，Clr-K455R会抑制Clr4催化组蛋白H3甲基化的能力，相对的Clr4-K455A则会促进甲基化（Fig.1c,1j）。

 

Figure 1

2：Clr4底物结合部位附近的晶体结构解析

研究者进一步详细解析了自我甲基化前/后的Clr4晶体结构（Fig.2），发现一个AI loop，位于455到472位氨基酸残基；在甲基化的Clr4中，AI loop的C端氨基酸（468到472）会排布成为一个α螺旋，从而结合并稳定Clr4上的SET-I结构域，使之也形成α螺旋（Fig.2b，右），这些有序的螺旋结构就不会阻挡甲基化底物的进入。在抑制型的Clr4蛋白中，AI loop的C端氨基酸（468到472）处于无序状态，相应的，AI loop与SET-I也失去结合、处于无序状态（Fig.2b，左），正是这种无序状态的结构形成“盖子”类似的结构，掩盖住了底物结合区域。除此之外已有其他的SET结构蛋白中SET-I结构域功能解析，认为其能通过与其他蛋白的结合起到底物识别等重要作用，意味着K455对于蛋白功能具有重要作用。

3：Clr4激活型和抑制型突变功能

Clr4-K455A仍旧具有催化组蛋白H3甲基化的活性（Fig.1c,3a），而且首先将Clr4甲基化会增强这种催化活性（Fig.3a），这说明可能还存在K455位以外的磷酸化位点。实验证明另一个甲基化位点是同样位于AI loop上的K472（Fig.3b），同时突变K455R和K472R会导致催化能力更低，相反K455A和K472A却会进一步提高催化能力（Fig.3b-c）。研究者构建了报告系统，即能够通过克隆颜色，反映报告基因ade6的沉默-即H3K9甲基化修饰水平高低，如Figure 3d所示，显示出与体外蛋白相同的水平，K455/472R能够抑制Clr4的H3K9me催化水平，而K455/472A及K455W则会促进甲基化修饰。ChIP测序结果也同样证实了H3K9me3水平在K455/472R中下降，以及K455/472A中上升。

Figure 3

依据催化甲基化能力、与K/R/A/W几个氨基酸残基的结构以及Clr4底物结合区附近的构象，研究者合理总结了几种氨基酸与结合能力的关系如下：

1）K：需要甲基化后，开放结合区域

2）R：封闭结合区域

3）A和W：不需要甲基化即开放结合区域，并因此导致更强的甲基化催化能力

接下来研究者分析了剂量效应：

首先有2个拷贝clr4的克隆对ade6有更强的抑制作用，即H3K9甲基化水平更高（Fig.S7b）；而K455/472R导致的失活则能够部分回补ade6表达的抑制（Fig.S7b）。

 

相反的是，激活型突变clr4-K455/472A剂量增加时，会导致ade6表达抑制水平降低（Fig.4a），以及H3K9甲基化水平的降低（Fig.4b-c），这可能来自于其他表观调控对于致死性的过度H3K9甲基化的补救。Epe是H3K9去甲基化酶；然而在激活型突变clr4-K455/472中进一步敲除epe非但没有促进ade6的沉默，反而是降低了其沉默水平（Fig.4d-e），这证明异染色质-H3K9甲基化以及细胞生存的调控，可能需要更多表观遗传因子的共同调控。

Figure 4

小结

本研究从结构解析开始，从晶体-分子结合-细胞行为三个方向分析了Clr4底物结合和催化活性的调节。

本文来自

Nahid Iglesias, Mark A. Currie, Gloria Jih, Joao A. Paulo, Nertila Siuti, Marian Kalocsay, Steven P. Gygi & Danesh Moazed. Automethylation-induced conformational switch in Clr4 (Suv39h) maintains epigenetic stability. Nature (2018).

Reference

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2. Min, J., Zhang, X., Cheng, X., Grewal, S. I. & Xu, R. M. Structure of the SET domain histone lysine methyltransferase Clr4. Nat Struct Biol 9, 828-832, doi:10.1038/nsb860 (2002).

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