Plus深读 | 多聚ADP核糖基化聚合酶是DNA复制中未连接冈崎片段的传感器

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https://www./molecular-cell/fulltext/S1097-2765(18)30446-5

多聚ADP核糖基化是随机DNA断裂修复时由PARP聚合酶合成的。在DNA损伤时，PARP1结合DNA单链断裂（single-strand breaks，SSBs）或DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）并被激活，是迅速感知DNA损伤的灵敏传感器¹。此外，PARP2和PARP3也可通过结合DNA断链而被激活。迄今为止，只有PARP1和PARP2活性能在细胞内检测，这或许是因为PARP3修饰蛋白主要是以单ADP核糖基化为主，PARP1和PARP2迅速将单ADP核糖基化蛋白转化为多聚ADP核糖基化蛋白。研究表明^{2, 3}，PARP1负责超过80%的多聚ADP核糖基化合成，而PARP2则负责剩余多聚ADP核糖基化合成。PARP在外源性遗传毒性诱导的DNA损伤中具有多种功能^4-6，包括染色体结构调控以及复制叉切除降解和重启等。然而，在正常细胞中，多聚ADP核糖基化形成源头及PARP信号的功能意义有待进一步研究。

在本研究中，研究工作者首先发现在正常细胞S期时，绝大多数多聚ADP核糖基化存在于DNA复制位点，这并非源自核苷酸的受损或错配以及DNA复制压力。接着，干扰LIG1或FEN1显著增加S期多聚ADP核糖基化（＞10倍），提示未连接的冈崎片段能激发S期PARP活性促进多聚ADP核糖基化。然后，使用依米丁特异性抑制DNA复制过程中冈崎片段合成，S期PARP活性减弱。进一步研究发现，在DNA复制时，PARP激活招募单链断裂修复蛋白XRCC1；缺失PARP活性或XRCC1的细胞对于FEN1抑制剂更加敏感。最终，该研究工作者提出S期多聚ADP核糖基化招募PARP依赖性的SSBR（single-strand breaks repair）是一种非经典的冈崎片段成熟途径。

一、知识积累

1，多聚ADP核糖基化（Poly(ADP-ribose)）⁷：指将多个ADP核糖基以共价或者非共价形式添加到蛋白（组蛋白和非组蛋白），由多聚ADP核糖基化聚合酶（poly(ADP-ribose) polymerases，PARPs）催化完成，广泛存在于真核生物，甚至单细胞生物，但并不存在于原核生物和酵母中，参与DNA损伤修复、基因组稳定性维持、转录调控以及凋亡和坏死等生物学进程，同时涉及着丝粒功能、有丝分裂纺锤体形成和端粒动态变化等生物学结构。

 

2，在外源性遗传毒性应激下，PARP信号在DNA损伤位点具有多种功能：

（1）在DNA断裂处，直接通过对组蛋白ADP核糖基化产生电荷排斥直接使染色质结构疏松，或者招募组蛋白修饰相关蛋白间接使染色质结构疏松⁴；

（2）多聚ADP核糖基化在DNA复制抑制剂诱导的DNA复制叉停留或者损伤位点形成后，抑制Chk1蛋白激酶、Mre11核酸酶和RECQ解螺旋酶活性，从而调节复制叉切除、降解和重启⁵；

（3）在最常见的基因毒素诱导的DNA损伤中，PARP1和PARP2结合在DNA SSBs被激活，通过活性氧和拓扑异构酶直接攻击糖磷酸骨架或者间接作为几种不同的DNA切割修复的必需中间体⁶。

 

3，重要蛋白整理：

（1）LIG1：也称DNA连接酶I，是一种ATP依赖性的DNA连接酶，在DNA复制过程中，起着连接冈崎片段的作用。

（2）FEN1：是核酸酶，在DNA复制过程中，负责去除冈崎片段5’端结构，便于后续LIG1连接冈崎片段。

（3）PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen）：增殖细胞核抗原，存在于细胞核，在G0～G1期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，在文中用于标记S期细胞。

（4）PARG：在缺少外源DNA损伤时，迅速介导內源多聚ADP核糖基化的降解。

（5）XRCC1：参与内源性随机的SSBs修复，但不具有酶活性，作为支架蛋白与多种修复酶相互作用。

（6）APE1：一种核酸内切酶，在DNA复制中出现核苷酸损伤或突变时，负责异常核苷酸切除，协助完成修复。

 

4，重要试剂整理：

（1）PARGi（PARG inhibitor）⁸：抑制PARG活性，便于检测内源性多聚ADP核糖基化；

（2）MMS（methyl methanesulfonate）：甲基磺酸甲酯，是一种烷化剂，诱导DNA损伤；

（3）HU（hydroxyurea）：羟基尿素，诱导DNA复制压力；

（4）FEN1i（FEN1 inhibitor）⁹：抑制FEN1活性，研究干扰FEN1是否影响多聚ADP核糖基化；

（5）Emetine：即依米丁，是一种DNA复制抑制剂，通过抑制冈崎片段形成发挥作用；

二、实验结果

1， PARP活性主要存在于S期DNA复制位点

研究工作者推断，在没有外源DNA损伤的情况下，由于PRAG介导多聚ADP核糖基化降解，内源性的多聚ADP核糖基化不易被检测到。因此，研究工作者尝试在 PARGi短时间孵育（15min~60min）细胞后检测多聚ADP核糖基化，如图1A，在DMSO对照组中，poly(ADP-ribose)水平较低，而在PARGi处理组中，poly(ADP-ribose)水平升高；使用PCNA标记S期细胞，在对照组和处理组中，poly(ADP-ribose)都与PCNA发生共染，仔细观察可见，少量poly(ADP-ribose)也存在于细胞核外，提示PARP活性主要存在S期DNA复制位点。接着，研究工作者利用敲除PARP1、PARP2和PARP3的RPE-1细胞进一步确定是哪种PARPs在S期多聚ADP核糖基化形成中起关键作用，如图1B和1C，PARGi处理后，与Wild type RPE-1（WT）相比，S期多聚ADP核糖基化在PARP1^-/-、PARP1^-/-/PARP2^-/-细胞中显著降低，但在PARP2^-/-和PARP3^-/-中轻微降低。因此，PARP1是负责S期DNA复制位点多聚ADP核糖基化合成的主要酶。

 

2， S期多聚ADP核糖基化不是源自DNA损伤或者DNA复制压力

为确定S期多聚ADP核糖基化的源头，研究工作者首先使用MMS诱导DNA损伤，如图2A，MMS处理后，poly(ADP-ribose)在G1、S和G2都升高；接着，研究工作者通过敲除XRCC1诱导随机SSBs，如图2B，poly(ADP-ribose)在XRCC1^-/-细胞的G1、S和G2都升高。因此，多聚ADP核糖基化在正常细胞S期升高不是DNA损伤引起的。

图1 S期DNA复制位点Poly(ADP-Ribose)检测

那么，S期多聚ADP核糖基化的升高是什么原因呢？研究工作者认为，可能是一种或多种S期特异的DNA损伤激发了PARP1的活性。一种可能性：在DNA复制时，核苷酸损伤或者引入尿嘧啶（U，用于RNA合成）都会启动S期DNA碱基切除修复机制¹⁰，继而引起多聚ADP核糖基化，其中APE1对于核苷酸损伤的切除起着关键作用。然而，研究工作者敲除APE1后并未引起多聚ADP核糖基化的升高（如图2C）。另外一种可能性：错配核苷酸切除修复导致的DNA断裂引起多聚ADP核糖基化。然而，与正常的HCT116细胞相比，PARGi处理后，多聚ADP核糖基化在MLH1/MSH3突变导致DNA错配修复缺陷型HCT116细胞中没有显著差异（如图2D）。还有一种可能性：核糖核苷酸的切除修复引起多聚ADP核糖基化。然而，研究工作者在野生型和Rnaseh2b^-/-小鼠胚胎成纤维细胞中，PARGi处理后，并未发现多聚ADP核糖基化存在差异（如图2E）。

PARP1能够结合停滞、反转和折叠的DNA复制叉被激活^{5, 11, 12}，研究工作者推测S期多聚ADP核糖基化是由DNA复制压力引起的。然而，如图2F，研究工作者并未发现poly(ADP-ribose)与γ-H2AX存在共定位的情况，使用HU诱导DNA复制压力，虽然可增加γ-H2AX水平，但并未增加poly(ADP-ribose)水平。

综上，多聚ADP核糖基化在正常细胞S期出现不是由DNA损伤或者DNA复制压力引起的。

图2 S期Poly(ADP-Ribose)的形成并非来自DNA损伤以及DNA复制压力

 

3， 干扰冈崎片段合成酶增加S期多聚ADP核糖基化

研究工作者推测S期多聚ADP核糖基化可能是DNA复制过程中一种或多种DNA复制中间体引起的。为验证这一猜想，研究工作者比较了LIG1突变的46BR人纤维母细胞和LIG1正常的1BR人纤维母细胞中多聚ADP核糖基化，如图3A，poly(ADPribose)水平在LIG1突变细胞内较高，而在PARGi处理后，与正常细胞相比，poly(ADPribose)水平在LIG1突变细胞内升高约14倍；更重要的是，在PCNA阴性细胞中，poly(ADPribose)水平并不存在差异，这提示S期增加的多聚ADP核糖基化与LIG1突变引起的未连接冈崎片段的增加是一致的，即S期多聚ADP核糖基化可能是未连接冈崎片段引起的。为进一步确定这种可能性，研究工作者使用抑制剂FEN1i抑制FEN1活性影响LIG1对冈崎片段的连接作用，如图3B和3C，在WT的RPE-1细胞中，FEN1i增加S期多聚ADP核糖基化，而当存在PARGi作用时，S期多聚ADP核糖基化水平增加约12倍，但在PARP1^-/-、PARP1^-/-/PARP2^-/-细胞中，FEN1i并未增加多聚ADP核糖基化。因此，这些数据提示S期多聚ADP核糖基化是未连接冈崎片段的分子识别器。

图3 干扰DNA复制蛋白LIG1和FEN1增加S期Poly(ADP-Ribose)

 

4， 抑制冈崎片段形成可阻断S期PARP活性

为了确定未连接冈崎片段是引起S期多聚ADP核糖基化的源头，研究工作者使用DNA复制抑制剂依米丁抑制冈崎片段的形成，S期多聚ADP核糖基化在RPE-1细胞（图4A）和U2OS细胞（图4B）中 都得到了明显抑制，即使在PARGi作用下也是如此。依米丁作用下多聚ADP核糖基化的抑制并不是依米丁直接阻止多聚ADP核糖基化合成引起的，因为依米丁并未封闭多聚ADP核糖基化在MMS诱导的随机DNA损伤位点的形成，也不是由于依米丁对DNA复制的非特异性作用，因为HU对DNA复制作用更大，但并未引起多聚ADP核糖基化的减少（图4B和4C）。因此，未连接冈崎片段引起S期多聚ADP核糖基化合成。

图4 依米丁抑制冈崎片段形成阻止S期ADP核糖基化

 

5， S期多聚ADP核糖基化招募SSBR支架蛋白XXRC1且保护细胞耐受FEN1抑制剂

以上数据提示PARP1和PARP2是未连接冈崎片段的传感器，研究工作者假设，S期多聚ADP核糖基化是未完成DNA复制的中间产物出现的信号，激活SSBR机制完成冈崎片段的连接。为验证这一想法，研究工作者在不同处理后的U2OS细胞中检测了XRCC1的表达情况，如图5A，在未添加去污剂时，XRCC1存在于PARGi处理后的部分U2OS细胞中，在添加去污剂时，XRCC1在DMSO对照组细胞中表达较低，但PARGi处理后，XRCC1在大多数U2OS细胞中表达升高；在PARGi处理后，XRCC1在WT RPE-1细胞中在DNA复制位点增多，但XRCC1在PARP1^-/-细胞中DNA复制位点表达减少，在PARP1^-/-/PARP2^-/-细胞中几乎完全废除，与XRCC敲减细胞相似（图5B），这与PARP1和PARP2对XRCC1的招募作用一致³；值得注意的是，在WT RPE-1细胞中，单单使用FEN1i抑制FEN1就能增加XRCC1招募。因此，S期多聚ADP核糖基化能招募XRCC1。

图5 S期PARP招募DNA修复蛋白XRCC1同时保护细胞不受FEN1抑制剂的作用

为了研究XRCC1依赖性SSBR对未加工冈崎片段的细胞耐受性的重要性，研究工作者比较了WT RPE-1细胞和XRCC1^-/- RPE-1细胞、PARP1-/- RPE-1细胞、PARP1^-/- /PARP2^-/- RPE-1细胞对FEN1抑制剂的敏感性，如图5C，与WT细胞相比，敲除XRCC1、PARP1、PARP2都增加了细胞对FEN1i的敏感性，提示这些蛋白可保护细胞耐受FEN1抑制剂。

 

6， 总结

本文研究工作者发现大量多聚ADP核糖基化合成于正常细胞的S期DNA复制位点，进一步的研究揭示PARP1是S期多聚ADP核糖基化合成的主要酶，深入研究提示多聚ADP核糖基化能识别未连接冈崎片段，招募XXCR1介导SSBR，完成冈崎片段的连接。

三、讨论与思考

1，本研究发现多聚ADP核糖基化在U2OS细胞、RPE-1细胞等多种正常细胞中主要存在于S期DNA复制位点，进一步借助PARGi抑制PARG活性从而抑制多聚ADP核糖基化的降解，发现其在S期大量合成。多聚ADP核糖基化常与外源遗传毒性诱导的DNA损伤有关，那么是否有可能是PARGi诱导DNA损伤进而促进多聚ADP核糖基化合成呢？研究工作者也想到了这一问题，长时间（24h）PARGi抑制PARG活性会诱导DNA复制叉损伤¹³，而短时间（15min~60min）PARG活性的抑制并不导致复制叉损伤⁸，在本研究中研究工作者采用PARGi处理都在1h以内，更重要的是，研究工作者检测PARGi处理后细胞内DNA损伤的marker γ-H2AX水平并未增加，此外，PARGi处理后，只有S期细胞中多聚ADP核糖基化显著增加，因此，在正常细胞S期检测到的多聚ADP核糖基化是细胞S期自身正常合成的而非PARGi诱导的，是抑制PARG活性后多聚ADP核糖基化降解被阻止的结果。

 

2，本研究中为了检测正常细胞中多聚ADP核糖基化，研究工作者不得不使用PARGi抑制PARG活性，从而阻止多聚ADP核糖基化的降解，这也告诉实验技术对于课题开展的重要性，我们不妨基于现有实验技术思考改进以期检测低表达的多聚ADP核糖基化：

PLA技术（Proximity Ligation Assay）¹⁴是一种特殊的免疫分析方法，通过一对邻位探针将特异性蛋白检测转化为DNA序列分析，即识别特定蛋白的抗体与DNA序列连接制备PLA探针，当同一蛋白的不同抗原位点被PLA探针识别后，由于临近作用，相邻的PLA探针通过连接反应形成一段可扩增的DNA序列标签，是一种高灵敏度的蛋白检测方法，当用于不同蛋白检测时，可以确定两个蛋白质是否存在相互作用。荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在细胞核中或染色体上显示DNA存在与含量的方法。

针对低水平多聚ADP核糖基化的检测，我们可以设计特定核酸序列标记ADP核糖基化抗体，然后根据特定核算序列设计FISH探针，先用PLA探针识别多聚ADP核糖基化，再用FISH探针识别PLA探针，从而提高多聚ADP核糖基化检测灵敏度。

 

3，既往研究显示多聚ADP核糖基化与外源遗传毒性诱导的DNA损伤密切相关，而本研究发现正常细胞中PARP1能监测未连接冈崎片段，我们不禁会思考，为什么正常细胞需要PARP1识别未连接冈崎片段呢？DNA复制发生在细胞的S期中，这一时期，大量的冈崎片段（三千万~五千万）大量合成，在经典的连接途径下实现冈崎片段的连接，以保障DNA复制的顺利完成，然而，冈崎片段的连接是一个巨大的工程，可能会出现错误，有些冈崎片段从经典连接途径中逃逸，这时细胞就激活PARP1，形成多聚ADP核糖基化，识别未连接的冈崎片段，招募XRCC1，启动SSBR完成冈崎片段的连接。这样思考可以解释PARP1对于正常细胞DNA复制的重要监控作用，但若能实时“抓拍”到PARP1、XRCC1以及冈崎片段在一起的场景更令人兴奋，或许可以这样尝试：在正常细胞中，干扰LIG1抑制冈崎片段连接，免疫荧光检测PARP1与XRCC1是否存在共定位，确定他们在空间位置上存在关系；在此基础上，为确定它们与冈崎片段的“相遇”，可能需要根据冈崎片段特异结构研发识别冈崎片段的实验技术。

 

4，本研究发现多聚ADP核糖基化存在于正常细胞的S期DNA复制位点，我们自然会思考哪些蛋白发生了多聚ADP核糖基化？染色体是由组蛋白和DNA组成的，在DNA复制时，DNA从核小体上解开以及复制后的重组，而本研究中多聚ADP核糖基化又存在于细胞核内，因此，可以推测多聚ADP核糖基化可能主要存在于组蛋白上，但仍需进一步的实验确定：首先，我们可以使用PARGi处理细胞提高S期多聚ADP核糖基化，同时使用流式细胞术富集S期细胞，裂解细胞后，使用ADP核糖基化抗体富集发生多聚ADP核糖基化的蛋白，采用合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行Western blot，检测组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4是否存在；其次，我们可以对富集的多聚ADP核糖基化蛋白进行蛋白质质谱鉴定，这样可以更全面揭示发生多聚ADP核糖基化的蛋白（包括组蛋白和非组蛋白），或许还能确定其他组蛋白修饰是否与多聚ADP核糖基化存在cross-talk。

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