图1: 理想情况下PCR产物与循环数关系 图2 理论情况下PCR产物量与循环数关系。 图3 实际情况下PCR产物数与循环数的关系 刚开始的时候酶,缓冲液,能量,dNTP等都是充足的,PCR按照理论情况下的扩增(A: 指数期),限速因子为底物的量; 随着时间的增加,产物越来越多,每次循环所需要的酶也就越来越多,当达到B(线性期)阶段的时候,所有的酶都参与了扩增,因此每个循环之后产物增加量是恒定的,和酶的数量相关,此时限制产物增加的因素是酶; 当达到C(衰退期)阶段时候,酶逐渐失活,dNTP消耗殆尽,产物增加量逐渐减少; 直至到D阶段,没有任何产物生成,数目保持恒定。 我们可以将每条PCR产物带上一个荧光标记(具体怎么回事下节讲解),这样的话有多少个PCR产物就有多少单位的荧光,因此: 荧光 正比于 DNA产物数目 某种关系于 DNA初始量 因此我们通过机器收集荧光的量就能知道DNA初始量了,那么机器如何收集荧光呢? 图4 固定循环数测定荧光强度值 图5 固定荧光强度测试循环数 只要我们把R0设置合适,R0这条水平线就能切割到所有的处于对数期的曲线,我们qPCR采用的就是这种模式,下面我们来看下为什么这种模式能够反映出DNA初始量(以下推导中lg代表以2为底的对数)。 一大波推导公式来袭~可直接看最后公式 如果你有一个实验组和一个对照组,那么实验组比对照组的比值就是2^-△△Ct,意思就是说实验组的mRNA水平是对照组的多少倍(Fold change)。 那么为什么不能用图4(固定循环数,测最终荧光强度值)的方式来衡量初始浓度呢?那是因为固定循环数的情况下,有很多样品不处于对数期,荧光的量与初始浓度没有特定的关系,无法计算初始浓度。 好了,不知道你是否已经明白其中的原理,我们下一节将介绍qPCR仪器运行的原理,让你真正理解qPCR~ “这哪是最清晰的QPCR讲解啊?” “客官请息怒,科研狗会努力做好,希望提出宝贵意见!汪汪汪” |
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