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编者按： m6A mRNA甲基化是最近几年的一个热点研究方向。从去年开始，许多高质量的m6A mRNA甲基化文章频频出现在CNS上，其中绝大部分出自表观遗传大牛芝加哥大学的何川教授。下面介绍的文献就是出自该实验室。这篇文献除了研究的内容新颖，具有前瞻性之外，通篇的逻辑结构也是值得反复阅读和借鉴的。 摘要 N6-甲基腺苷（m6A）mRNA甲基化是影响发育和肿瘤中细胞分化和增殖的基因调节机制。为了研究m6A mRNA甲基化在细胞增殖和致瘤性中的作用，作者研究了人子宫内膜癌，其中热点R298P突变存在于甲基转移酶复合物（METTL14）的关键组分中。作者发现大约70％的子宫内膜肿瘤表现出m6A甲基化的减少，这可能是由于这种METTL14突变或甲基转移酶复合物的另一组分METTL3的表达降低。这些变化可能通过激活AKT途径导致子宫内膜癌细胞的增殖和致瘤性增加。 m6A甲基化的减少导致阴性AKT调节物PHLPP2的表达降低和阳性AKT调节物mTORC2的表达增加。总之，这些结果揭示了m6A mRNA甲基化作为子宫内膜癌中的致癌机制，并且m6A甲基化是AKT信号传导的调节因子。 正文 N6-甲基腺苷（m6A）是人类中最普遍的mRNA修饰。这种修饰是可逆的。由核心METTL3-METTL14 m6A甲基转移酶和调节亚基组成的复合物催化mRNA的m6A甲基化。至少两种酶FTO和ALKBH5介导这种甲基化的逆转。m6A mRNA甲基化通过影响细胞分化期间的mRNA转换来调节干细胞的自我更新和分化，并且在胚胎发育期间在转录组转换中起关键作用。m6A mRNA甲基化在各种肿瘤中的起始和进展的途径中出现。 m6A mRNA甲基化影响干细胞和癌细胞的生长和增殖。然而，m6A甲基化如何影响细胞生长以及哪些潜在的途径和机制介导这些变化仍未完全阐明。在作者在子宫内膜癌中研究了这个问题，其中测序研究已经确定了m6A甲基转移酶亚基METTL14的高频突变。与配对的正常子宫内膜相比，约70％的子宫内膜肿瘤表现出m6A甲基化降低。这些m6A甲基化的减少可能是由METTL14的突变或METTL3甲基转移酶的表达降低引起的。这些结果表明m6A甲基化的体细胞突变是促进肿瘤进展的重要因素，揭示m6A mRNA甲基化减少很可能是大部分子宫内膜癌的致癌机制。 结果 作者首先发现R298P热点突变显著降低了m6A甲基化复合物的RNA甲基化催化活性（图1a）。 尽管过表达野生型METTL14促进了HEC-1-A子宫内膜癌细胞中细胞poly（A）RNA的m6A甲基化，但突变METTL14在过表达时似乎无活性（图1b）。 虽然野生型METTL14的过表达降低了细胞增殖，但突变体的过表达对细胞增殖没有明显影响（图1c），表明METTL14突变可能是一种表现为功能丧失的等位基因。与来自野生型邻近正常组织的mRNA相比，来自三个突变肿瘤的mRNA具有降低的总体m6A甲基化（P = 0.04），表明METTL14（R298P）突变抑制肿瘤m6A mRNA甲基化（图1d）。 图1：METTL14突变和METTL3与m6A mRNA的关联 与邻近的正常子宫内膜组织相比，所有肿瘤中约70％（包括大多数具有野生型METTL14的肿瘤）表现出总m6A mRNA甲基化减少（图1e）。 作者通过RT-qPCR评估了肿瘤和邻近正常子宫内膜组织中m6A相关复合物的表达情况（图1f）。作者发现METTL3表达减少与这些肿瘤组织中m6A甲基化的减少相关（图1g）。 具有正常子宫内膜和上皮子宫内膜癌样本的免疫组化显示了在蛋白质水平的肿瘤组织中METTL3表达显著降低（图1h）。 METTL14 +/-细胞表现出m6A mRNA甲基化减少，并且m6A甲基化的减少与肿瘤样品中观察到的相似（图2a）。与METTL14在子宫内膜癌中丧失功能的作用一致，METTL14的杂合敲除增加了细胞增殖，集落形成，细胞迁移和侵袭（图2b-e）。通过野生型METTL14但不是突变型METTL14的稳定表达，可以部分挽救因m6A甲基化减少引起的细胞生理学变化（图2a-e）。与突变型METTL14的表达相似，METTL3的敲低相对于对照细胞降低了m6A mRNA甲基化的总体水平并促进了细胞增殖，集落形成，迁移和侵袭（图2f-j）。相对于野生型HEC-1-A细胞，METTL14 +/-敲除细胞显示出更大的肿瘤和转移数量的增加（图2k）。当比较用野生型和突变型METTL14拯救METTL14 +/-细胞时（图2l）和将METTL3敲低的HEC-1-A细胞与对照（图2m）进行比较时，可以观察到类似的趋势。总之，这些结果表明，在患者子宫内膜肿瘤样本中观察到的m6A mRNA甲基化减少，无论是由METTL14（R298P）突变还是由METTL3表达降低诱导，都可以促进子宫内膜癌细胞的致瘤性，并可能在子宫内膜癌细胞的发展过程中起关键作用。 图2：降低的m6A甲基化增加了细胞增殖迁移等 在超过一半的患者样本中检测到的m6A峰中，作者发现与邻近的正常对照组织相比，肿瘤中m6A mRNA甲基化全局减少（图3a）。 在至少两个样品中显示减少的m6A甲基化转录物富集在细胞迁移，增殖，生长，粘附和细胞死亡相关的基因通路（GO）上（图3b）。 GO分析确定AKT /蛋白激酶B信号通路在患者样本（P = 1.51×10-8）和子宫内膜癌细胞系（P = 1.02×10-8）中通过减少m6A甲基化而发生显著改变（图3b）。 与肿瘤相邻组织相比，参与AKT途径的许多基因显示其肿瘤中m6A甲基化减少（图3c，d）。 图3：m6A甲基化降低的肿瘤测序结果 作者接下来通过研究AKT的磷酸化状态来确定子宫内膜癌细胞中m6A甲基化减少是否会影响AKT信号传导。 与相关对照细胞系（分别为野生型HEC-1-A细胞，野生型METTL14和shControl）相比， METTL14功能丧失的HEC-1-A细胞系（METTL14 +/-，突变体METTL14和shMETTL14）显示AKT Ser-473磷酸化增加（图4a）。 相反，Thr-308的磷酸化和总AKT蛋白表达保持不变（图4a）。 为了评估这些AKT磷酸化的变化是否刺激AKT信号传导，作者检测了AKT下游蛋白的磷酸化状态（图4b）。 图4：降低的m6A激活了AKT 编码PHLPP2的转录物和mTORC2复合物的三种组分（PRR5，PRR5L和mTOR）显示其在患者样品中m6A甲基化降低（图4c）。 这些转录物还在METTL14缺失和METTL3敲低HEC-1-A细胞系中显示出m6A甲基化降低（图4d）。 为了研究蛋白质表达的这些变化是否发生在肿瘤组织中，作者在正常子宫内膜和子宫内膜肿瘤中进行组织免疫组化（IHC）染色（图4e，f）。 HEC-1-A细胞中YTHDF1的短干扰RNA（siRNA）敲低使PHLPP2的表达降低至与敲低METTL3相似的程度（图5a）。PHLPP2表达的这些变化不是由于PHLPP2转录物丰度的变化，而是由于PHLPP2转录物与活跃的转录核糖体的结合（图5b，c）。siRNA敲低 YTHDF2增加了PRR5，PRR5L和mTOR转录物的丰度，并且这些转录物在YTHDF2敲低后显示降低的RNA衰减速率（图5b，g-i）。 图5：Akt 通路受到m6A阅读蛋白的调节 为了证实作者的结果不仅仅在HEC-1-A子宫内膜癌细胞系，作者在基质细胞（T-HESC），一种正常的非转化细胞系，发现了类似的m6A介导的细胞增殖和AKT信号传导的变化（图6）。 图6：m6A在T-HESC细胞系中的情况 PHLPP2的过表达（图7a）和RICTOR的敲低（图7b）都降低了METTL3敲低，METTL14突变体和METTL14 +/- HEC-1-A细胞中p-AKT（S473）的水平。 METTL3敲低细胞中的PHLPP2过表达或RICTOR敲低降低了细胞增殖速率，而这些处理对对照细胞的影响小得多（图7c）。 图7：m6A通过Akt通路来介导细胞增殖 小结 该研究层次结构清晰，适合刚入门表观遗传或者m6A甲基化研究阅读。该文献很好地展示了如何从疾病中发现m6A相关复合物的异常变化（figure1），从而进一步发现其和肿瘤的增殖等表型存在关联（figure2）。之后，再通过测序和通路分析发现m6A相关复合物的异常变化和细胞增殖、AKT信号通路激活存在关联（figure3）。随后通过实验，进一步验证了m6A相关复合物和AKT激活存在上下游的因果联系（figure4）。而在m6A相关复合物和AKT激活之间，作者通过PHLPP2和mTOR建立联系，即PHLPP2和mTOR的m6A甲基化导致了AKT激活。最后，作者再进行简单的验证，m6A甲基化通过PHLPP2和mTOR来促进AKT激活和细胞增殖（figure7）。 全篇逻辑严谨，在m6A相关复合物（机制），m6A甲基化（机制），PHLPP2和mTOR（机制），AKT激活（机制），细胞增殖（表型）和肿瘤发生（疾病）这一条线上，逐一进行验证。在in vitro层面，作者只做了m6A相关复合物和肿瘤发生的关系研究，当中缺少进一步验证AKT激活的情况。  |
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