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摘要：由于单克隆抗体技术发展日异月新，但是很多关于单克隆抗体的基本结构和知识需要梳理，结合自身细胞培养经验，总结细胞培养工艺对于IgG功能影响，便于行业内健康快速发展。 从单抗发展的技术角度分类，见表1，主要分为鼠源单抗、嵌合单抗、人源化单抗、全人源化单抗，由于副反应作用或免疫原性等原因，目前主要以人源化单抗和全人源化单抗为主； 从IgG结构来分，主要有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1、IgA2等，见下图，IgG1具有ADCC、CDC效应，蛋白稳定，也是形成抗体药物最多的结构；IgG2和IgG4两个结构，ADCC和CDC效应表现很弱，FDA批准单抗药物IgG2形式，只有 EGFR靶点的单抗药物；IgG3蛋白不稳定，容易形成聚体，而且不能protein A纯化，所以还没有形成单抗药物。 从IgG单抗形成药物（截止2017年5月份FDA批准），下表也显示了单克隆抗体药物主要是IgG1形式，其次PD-1或PDL-1单抗是IgG4形式； List of approved monoclonal antibodies for tumor therapy and their isotype/subclass 如下图，IgG的结构及生物学功能显示，ADCC和CDC活性主要与Fc片段的糖链有关系，人源 Ig G 的 Fc 上的 N- 糖链以核心岩藻糖基化的二天线复杂型为主 ( 下图)，此外，也存在少量的非核心岩藻糖基化的复杂型或杂合型 N-糖链。Fc 上的 N- 糖链不仅影响抗体的结构及热稳定性，而且还可以通过与免疫细胞 (NK 细胞、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等 ) 表面的 Fc 受体结合产生 ADCC 作用，与补体 C1q 结合以引起 CDC作用，与新生儿 Fc 受体(neonatal Fc receptor, Fc Rn)结合影响抗体的血清半衰期等。 IgG 分子是血液中含量最多的糖蛋白，在正常人血液中，几乎所有 Ig G 的 Fc 都含有至少两个保守的 N- 糖基化位点。此外，在记忆 B 细胞快速合成大量抗体的过程中，编码轻链或者重链可变区的基因片段可能会通过体细胞超级突变的方式改变抗体可变区的氨基酸序列，该过程极有可能伴随 Fab上 N- 糖基化位点的变化。Bondt 等研究表明，15%~25% 的血清 Ig G 的 Fab 上存在 N- 糖基化修饰。此外，尽管 Fc 和 Fab 上的 N- 糖链均以二天线复杂型为主，它们的糖型却存在较大差异，前者包含更高比例的核心岩藻糖，而后者则含有更高比例的半乳糖、唾液酸和平分型 N- 乙酰葡萄糖胺等 。与蛋白质及核酸等大分子不同，糖链的合成是一个非线性模板驱动过程，其结构受到基因与环境等诸多因素的影响。B 细胞或浆细胞中的糖基转移酶和糖苷酶的表达水平以及机体的血清环境均可能改变Ig G 的糖基化。Axford 等和 Omtvedt 等的研究指，Ig G 上去半乳糖基化修饰的增多是由于浆细胞中半乳糖转移酶活力降低或表达量下降，而不是在血清中被半乳糖苷酶切除所造成。Jones等发现，血清中存在的分泌型唾液酸转移酶(ST6Gal1) 可以灵活地调节 Ig G 分子的末端唾液酸化程度，且这种分泌型的唾液酸转移酶可能来自于肝脏的中央静脉内皮细胞。此外，炎症因子如 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 可影响 α2-6 唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶Ⅵ的表达。综上所述，Ig G 糖链结构是机体生理状态的一种综合反映。 提高ADCC生物学活性，从宿主细胞FUT8基因改造到细胞培养工艺调节，都可以得到显著提高，例如CHO宿主细胞敲出FUT8基因之后，ADCC活性可以提高100倍；培养工艺对最终生物制品的产量、质量和安全有巨大影响，其中以细胞培养基的选择最为重要，影响糖型修饰。在筛选培养基和补料培养基时，初期流加培养时候基础培养基和同品牌的补料培养基应该配对进行筛选。初步筛选之后，将基础培养基和补料培养基进行分类，如促进生长类型、维持活率类型、促进表达类型、影响糖型修饰类型等。将培养基进行混合优化时，尽量将不同类型的培养进行组合，并且应用实验设计( design of experiment，DOE) 优化。在反应器中对于pH、DO 值、CO2分压、搅拌速度、温度、乳酸耐受能力、NH4+耐受能力以及葡萄糖浓度等条件对于糖基化修饰有可能影响，不同的项目影响不一样。同时不同的克隆表现也不一样，尤其是糖基化修饰，所以在早期克隆筛选阶段，也需要考察。 参考文献 1.Feng Li,Natarajan Vijayasankaran, Amy (Yijuan) Shen,Robert Kiss and Ashraf Amanullah, Cell culture processes for monoclonal antibody production.2010 Landes Bioscience 2.Structure and Function of Diversifying Receptors j IgG Structure and Function. Christy A Thomson, Amgen British Columbia Inc., Burnaby, BC, Canada. Encyclopedia of Immunobiology, Volume 2 http://dx./10.1016/B978-0-12-374279-7.05002-5 3.Ig G糖基化与疾病相关性研究进展. 张芳，许之珏，徐颖姣，邹霞，张延.生命科学. 第29卷第4期 4.Anna Kretschmer Ralf Schwanbeck Thomas Valerius Thies R ner， Antibody Isotypes for Tumor Immunotherapy，Transfus Med Hemother 2017;44:320–326 培训推荐 |
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