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点评丨李大力（华东师范大学教授） 责编丨迦 溆 CRISPR/Cas9基因编辑系统利用Cas9核酸内切酶结合sgRNA对靶DNA进行切割，诱发DNA进行非同源末端连接（Non-homologous End Joining，NHEJ）或同源重组（Homology-directed repair，HDR）损伤修复机制，进而实现靶基因序列突变。2016年，David R. Liu课题组建立了基于CRISPR/Cas9技术的高效诱导单一核苷酸突变的胞嘧啶单碱基编辑器（BE3），通过nickase Cas9蛋白（nCas9）上偶联大鼠胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1），可以将靶位点C·G转变为T·A【1】。由于该系统避免了传统CRISPR/Cas9导致DNA双链断裂可能带来的损伤，迅速被国内外科学家应用于不同物种的基因编辑。单碱基编辑系统除可以进行单个氨基酸位点的基因编辑以外，理论上还可以通过氨基酸位点的遗传筛选进行蛋白结构和功能的在体研究，不过该应用至今未见报道。 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组长期从事小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞及其应用的研究。2012年，李劲松研究组与徐国良研究组合作首次建立了孤雄单倍体胚胎干细胞，并证明这些细胞能够代替精子使卵母细胞“受精”产生半克隆小鼠，不过该技术产生半克隆小鼠的效率低下【2】。2015年，李劲松研究组和杨力研究组合作，通过删除两个印记调控区域（Differentially Methylated Region, DMR）, H19-DMR和IG-DMR，获得了能够高效产生半克隆小鼠出的孤雄单倍体胚胎干细胞（“人造精子”）【3】。基于上述前期研究成果，李劲松课题组推测，“人造精子”介导的半克隆技术与BE3技术结合，有可能实现特定蛋白质关键氨基酸的在体遗传筛选。 10月1日，Nature Cell Biology 在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所李劲松和陈勇研究组题为CRISPR–Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development的最新合作研究成果。该工作利用最新的CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑系统 （BE3 ）结合单倍体胚胎干细胞（“人造精子”）介导的半克隆技术，对影响小鼠原始生殖细胞（PGCs）发育的重要基因Dnd1实现个体水平氨基酸功能位点的遗传筛选（Dnd1突变会导致小鼠PGCs缺陷和不育【4】）。 在这些研究中，研究人员首先在小鼠胚胎干细胞系中，通过碱基编辑器（BE3）的N端和C端同时加上一个核定位序列，建立了高效的单碱基编辑系统。之后，他们将该系统应用于小鼠“人造精子”上，发现优化的BE3不仅可以在“人造精子”上实现高效的单碱基编辑，将携带BE3的“人造精子”注入卵子还可以高效地产生纯合点突变的半克隆小鼠。紧接着，他们向“人造精子”中导入了一个靶向Dnd1基因的一个sgRNA慢病毒文库（含77个sgRNA），发现能在半克隆小鼠中高效地诱导不同位点的单碱基突变。通过两轮的遗传筛选，他们发现并验证DND1的E59K、V60M、P76L和G82R对PGCs的发育具有重要作用（严重影响PGCs的形成，下图）。 之后，通过与陈勇课题组合作，他们通过蛋白结构的预测、突变后蛋白的稳定性、蛋白与蛋白相互作用等多个层次分析发现这些位点对于DND1蛋白质稳定性和其与其它蛋白质相互作用起着关键的作用。 示意图：“人造精子”结合碱基编辑技术实现蛋白质重要氨基酸的在体遗传筛选 总的来说，该工作在国际上首次利用碱基编辑技术实现了个体水平蛋白质关键氨基酸功能位点的遗传筛选，为蛋白质结构和功能的研究开辟了一个新的体系。该体系的另一潜在的重要应用是筛选的人类疾病相关基因的功能位点，并与已有的SNVs数据库进行比对，预测疾病相关基因的致病位点。 据悉，该工作在李劲松和陈勇研究员的共同指导下，由李劲松组博士生李庆和陈勇组博士后黎颜景等完成。 参考文献： 1、Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., & Liu, D. R. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420. 2、Yang, H., Shi, L., Wang, B. A., Liang, D., Zhong, C., Liu, W., ... & Li, J. (2012). Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell, 149(3), 605-617. 3、Zhong, C., Yin, Q., Xie, Z., Bai, M., Dong, R., Tang, W., ... & Li, J. (2015). CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library. Cell Stem Cell, 17(2), 221-232. 4、Youngren, K. K., Coveney, D., Peng, X., Bhattacharya, C., Schmidt, L. S., Nickerson, M. L., ... & Rubin, E. M. (2005). The Ter mutation in the dead end gene causes germ cell loss and testicular germ cell tumours. Nature, 435(7040), 360. 专家点评 李大力（华东师范大学生命科学学院教授） CRISPR/Cas9技术不仅可以精确的编辑基因改变物种性状和开展基因治疗，利用sgRNA文库在细胞系或单细胞生物中进行大规模筛选已经成为功能基因筛选的重要研究手段。比如，利用野生型的Cas9和靶向增强子等DNA调控区域的sgRNA文库，可以解析增强子的功能区域【1】，发现重要毒素的受体基因（北京大学魏文胜课题组）【2】，甚至是鉴定肿瘤免疫治疗的新靶点【3】（Dana-Farber 癌症研究所Nicholas Haining实验室）。而将胞嘧啶或腺苷脱氨酶与Cas9酶活缺陷型（主要是nickase）融合形成的新一代单碱基编辑工具Base editor（BE）4和adenosine base editor （ABE）【5】，则为单个碱基分辨率的基因编辑筛选提供了新的可能性。例如，中科院常兴课题组等将胞嘧啶脱氨酶AID与Cas9突变体结合，通过sgRNA文库对抗癌药物靶蛋白进行单碱基的饱和突变筛选，发现了新的突变可以产生对靶向药物的耐药性【6,7】。 迄今为止，绝大部分的筛选研究都是以细胞系、酵母、细菌等细胞系或单细胞生物作为对象，主要是它们都易于培养，容易控制单个sgRNA进入到一个细胞排除干扰，同时也易于找到合适的筛选体系富集所需要的突变。但是，单细胞的筛选体系无法模拟复杂的生命过程，具有很大的局限性，然而要想在复杂生物体内和特定发育时期进行筛选技术难度非常大。 上海中科院生化细胞所李劲松课题组利用前期建立的基于孤雄胚胎干细胞的“半克隆”技术【8】，率先利用BE3单碱基编辑技术，在小鼠中完成了对生殖细胞发育关键蛋白DND1重要氨基酸筛选，发现关键位点的单点突变可以导致不育的表型。传统的通过将BE3 mRNA/sgRNA直接进行胚胎注射的方法所产生的F0代小鼠往往是嵌合型，从F0代得到纯和突变动物一般需要两代，大约需要半年左右的时间，即便对于十数个靶点，繁育不同突变小鼠所需要的时间和工作量都是非常巨大的。 在Nature Cell Biology发表的这篇论文中，李劲松课题组首先通过增加核定位信号对BE3进行了优化，提高了编辑效率。针对DND1蛋白的外显子设计了约80条sgRNA序列，在孤雄单倍体ES细胞中进行筛选，确定筛选出的细胞能够包含全部sgRNA序列后进行半克隆小鼠制备。最后发现DND1蛋白上4个关键的氨基酸突变（ E59K, V60M, P76L，G82R）导致小鼠无法正常形成原始生殖细胞而导致不孕不育。通过验证和机制分析，证实突变引起了蛋白质错误折叠，使DND1蛋白稳定性下降并影响了与NANOS2相互作用的能力，从而导致了小鼠的不孕不育。 李劲松老师课题组的这篇论文，以DND1这个关键蛋白为例证明了单碱基编辑结合“半克隆”小鼠技术是解析蛋白质关键氨基酸功能的开创性方法。由于人体的许多基因和小鼠具有较高的同源性，运用这一方法，也可以快速规模化地建立精确位点突变小鼠库，为在整体动物层面验证GWAS分析所鉴定出的潜在人类疾病关键基因的功能性位点提供了可行、可靠的技术路线。 参考文献 1. Canver, M. C. et al. BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature 527, 192–197 (2015). 2. Zhou, Y. et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature (2014). doi:10.1038/nature13166 3. Manguso, R. T. et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature (2017). doi:10.1038/nature23270 4. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016). 5. Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464–471 (2017). 6. Hess, G. T. et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nat. Methods (2016). doi:10.1038/nmeth.4038 7. Ma, Y. et al. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nat. Methods 13, 1029–1035 (2016). 8. Yang, H. et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell (2012). doi:10.1016/j.cell.2012.04.002 |
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