慢病毒的使用

病毒载体是基因工程研究中的一柄利器。运用它，我们可以高效地让目标基因过表达或者被特异性地敲低。科研中用到的病毒主要有慢病毒、腺病毒、腺相关病毒。根据各种病毒不同的特性，不同的课题需要包装不同的病毒。比如，腺相关病毒更适合进行动物体上的研究。腺病毒具有包装容量大、适合瞬时表达的研究等。

各类病毒类载体中，生物基因科研中使用得最多的是慢病毒载体。慢病毒具有可插入外源基因容量大、目的基因整合靶细胞基因组稳定表达、可同时感染分裂期和非分裂期的细胞、侵染效率高的特点，已经广泛应用于基础科研、临床研究中，比如抗体、CAR-T的制备。

首先，要做预实验！

文献报道或他人经验中的MOI值（multiplicityof infection，即感染复数，含义是感染时病毒与细胞数量的比值）只可作为参考，其受大量不确定因素的影响，如特定病毒对细胞的亲噬性、不同滴度测定方法的误差、过程损耗、细胞状态、传代次数、细胞密度、实验操作等。实际情况在各个实验室也会存在一定差异。预实验的目的是找出能够达到最高感染效率、同时细胞状态不会受到明显影响的一个恰当的病毒用量。

预实验方案！

设置不同MOI值的感染组。举个例子：可设立5、10、20、50的MOI值梯度，各两孔，其中一孔加入终浓度为5 ug/ml的polybrene（聚凝胺，用于提高病毒感染细胞的效率）。如果只需通过荧光显微镜观察，则使用96孔板（细胞量参考文末的列表）即可。如需做Real-time PCR或流式检测则至少使用24孔板。在24 h换液，在72 h左右检测感染效率及表达水平。

如果有文献报道的MOI值（参考文末的列表），可使用该值的0.5x、1x、2x、4x进行测试。如使用较难感染的细胞（如悬浮细胞、某些原代细胞等）进行实验，建议设置易感染细胞组如293T作为对照。

以24孔板为例~

第一天，铺板靶细胞。在24孔板中接种目的细胞约5x104/孔，每孔完全培养基0.5 ml。靶细胞的状态对于感染及表达非常重要。

第二天，取出病毒置于4℃冰箱或冰袋上融化，如需稀释毒液可以用完全培养基进行稀释。观察靶细胞，进行病毒感染时细胞应状态良好，汇合度在50-60%左右。

第三天，给侵染病毒的靶细胞换液，放入培养箱培养48h。

第五天，按照正常培养基条件继续培养48 h后可检测感染效率。在倒置荧光显微镜观察细胞的荧光表达情况，估计慢病毒感染目的细胞的效率。如未携带荧光标记元件的，可以通过Real-time PCR检测目的基因表达。慢病毒表达产物在侵染后的72-96 h左右达到高峰，如细胞生长代谢缓慢需适当延长时间，生长旺盛的细胞在48 h即可观察基因表达。

正式实验！

根据预实验结果，按滴度计算毒液所需的用量。如原始滴度为1x108TU /ml，每孔计划使用病毒用量为0.5x106 TU，则需要使用原液5 ul。将所需用量的毒液加入完全培养基（500ul）、混匀。移除孔板中的上清，加入混合病毒液。放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2）孵育培养。如靶细胞状态良好可在12-24h更换培养基，病毒孵育时间不短于48 h。需要使用polybrene时，在孵育培养基中先于病毒液加入，且终浓度5 μg/ml。

收尾！

上述实验所使用过的所有废弃物，均需要完全浸泡在3-5%的84消毒液中至少1h，然后沥干经过高压灭菌处理，目的是使其中的生物活性完全消灭。有条件的，建议完全焚烧。

未用完的病毒液，置于-80℃长期保存。需要在24h内继续实验的，可以暂存于4℃。反复冻融会影响病毒滴度，所以建议将病毒液小量分装，用多少取多少。

附表：

（1）常用细胞系参考MOI值

细胞名称	中文名称	80%感染率所需MOI
293T	人胚肾上皮细胞	1
A375	人黑色素瘤细胞	10
A498	人肾癌细胞	100
A549	人肺腺癌细胞	20
A673	人横纹肌瘤细胞	10
ACHN	人肾癌细胞	10
AGS	人胃癌细胞	100
AsPC-1	人胰腺癌细胞	10
B16	小鼠黑色素瘤细胞	＞100
BEL-7402	人肝癌细胞	10
BGC823	人胃癌细胞	100
BRL	大鼠肝细胞	20
BRL-3A	大鼠肝细胞	100
BTT	小鼠膀胱癌细胞	20
C127	小鼠乳腺癌细胞	100
C6	大鼠脑胶质瘤细胞	＞100
Capan-1	人胰腺癌细胞	10
CFPAC-1	人胰腺癌细胞	50
CHO	中国仓鼠卵巢癌细胞	20
CNE	人鼻咽癌细胞	10
CNE2	人低分化鳞癌鼻咽癌细胞	50
COC1	人卵巢癌细胞	＞100
Daudi	人Burkitt’s淋巴瘤细胞	＞100
DLD-1	人结直肠肿瘤细胞	10
DU145	人前列腺癌细胞	20
EC9706	人食管癌细胞	10
Eca109	人食管癌细胞	20
GBC-SD	人胆囊癌细胞	30
GH3	大鼠垂体腺瘤细胞	100
HaCaT	人永生化表皮细胞	＞100
HCC1937	人乳腺癌细胞	50
HCT116	人结直肠癌细胞	10
Hela	人宫颈癌细胞株	10
HepG2	人肝癌细胞	10
Hep-2	人喉癌细胞	10
Hepa 1-6	小鼠肝癌细胞	100
hFOB 1.19	人胎儿成骨样细胞	20
HL-60	人急性髓系白血病细胞	＞100
HL-7702	人肝正常细胞	20
HOS	人骨肉瘤细胞	20
HSC-T6	大鼠肝星形细胞	10
HT-29	人结肠癌细胞	10
Huh-7	人肝癌细胞	10
HUVEC-2C	人脐静脉血管内皮细胞	10
IEC6	大鼠肠上皮细胞株	10
JB6	小鼠表皮细胞	＞100
JEG-3	人绒癌细胞系	100
Jurkat	人T细胞白血病细胞	50
K562	人慢性髓性白血病细胞	20
KB	人口腔上皮癌	10
L6	大鼠成肌细胞	50
Lewis	小鼠肺癌细胞	20
LNCaP	人前列腺癌细胞	5
LoVo	人结肠癌细胞	10
MCF-7	人乳腺癌细胞	20
MDA-MB-231	人乳腺癌细胞	10
MDA-MB-468	人乳腺癌细胞	10
MDPC-23	小鼠成牙本质细胞样细胞	＞100
MG-63	人成骨肉瘤细胞株	50
MGC-803	人胃癌细胞	50
MIN-6	小鼠胰岛素细胞	100
MKN-28	人胃癌细胞株	20
MKN-45	人胃低分化腺癌细胞株	20
MOLT-4	人T淋巴细胞白血病细胞株	＞100
MRC-5	人胚肺成纤维细胞	10
NB4	人白血病细胞	50
NCI-H125	人肺腺癌细胞	＞100
NIH-3T3	小鼠胚胎成纤维细胞系	20
NRK	大鼠肾细胞	100
PANC-1	人胰腺癌细胞	2
PC-3	人前列腺癌细胞	20
Raw264.7	小鼠单核巨噬细胞白血病细胞	10
RKO	人结肠癌细胞	2
RPE	人视网膜色素上皮细胞	10
Saos-2	人骨肉瘤细胞	10
SCaBER	人膀胱鳞癌细胞	200
SEG-1	人食管腺癌	100
SGC-7901	人胃癌细胞	10
SHG-44	人脑胶质瘤细胞	10
SHZ-88	大鼠乳腺癌细胞	20
SK-BR-3	人乳腺癌腹腔转移癌细胞株	50
SK-N-SH	人SK神经母细胞瘤	20
SK-OV-3	卵巢癌细胞株	2
SMMC-7721	人肝癌细胞	10
SPC-A-1	人肺腺癌细胞	100
SW1990	人胰腺癌	50
SW480	人结肠癌细胞	10
SW620	人结肠癌细胞	100
SW982	人滑膜肉瘤	20
T24	人膀胱癌	5
T-47D	人乳腺癌细胞	50
Tca8113	人舌鳞状细胞癌细胞	10
THP-1	人急性单核细胞白血病细胞	50
U2 OS	人骨肉瘤细胞	5
U251	人脑胶质母细胞瘤	10
U87	人脑星形胶质母细胞瘤	3
U937	人单核细胞	50
Vero-E6	非洲绿猴肾细胞	5

 

（2）常用培养器皿使用参数

种类	底面积 (cm2)	培养基工作体积 (ml)	平均细胞产量
96孔板	0.32	0.1 –  0.2	3.2 x 104
48孔板	0.95	0.2 – 0.3	9.5 x 104
24孔板	1.9	0.4 –  0.6	1.9 x 105
12孔板	3.8	0.8 – 1.2	3.8 x 105
6孔板	9.5	2 –  3	9.5 x 105
100mm 皿	55	8 – 15	5.5 x 106
150mm 皿	152	25 –  40	1.5 x 107
T75 瓶	75	15 – 22	7.5 x 106
T175 瓶	175	30 –  50	1.75 x 107