如何用干细胞生成脑类器官？这个视频你一定要看！

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早在2103年奥地利科学家就培育出了人“大脑类器官”。奥地利分析生物科技研究所研究员玛德丽娜-兰卡斯特指出，这些类器官的构成与一个9周或者10周大的胚胎的大脑类似。研究中，兰卡斯特和同事共培育了数百个类器官。在发育初期，人类大脑的一些主要区域以及类似中脑和后脑等区域已经拥有可辨认的特征，包括背侧皮层、腹侧前脑以及产生脑脊髓液的脉络丛。拉纳卡斯特和同事指出他们在所培育的迷你大脑的同样区域也发现了这些特征。

脑类器官教学视频

上期我们推出了肠类器官教学视频，得到了老师们的广泛好评，本期为大家带来的是我们新鲜出炉的脑类器官教学视频！

视频中描述了如何从人多能干细胞生成脑类器官的详细操作步骤，包括类胚体的形成、神经诱导、神经上皮扩张和类器官的成熟（图1）。

图1. STEMdiff^TM脑类器官试剂盒的示意图

将在mTeSR1™中维持培养的人多能干细胞（胚胎干细胞或诱导多能干细胞）使用温和细胞解离试剂（GCDR）解离为单细胞悬液，以密度为9000细胞/孔接种至U-Bottom 96孔超低粘附培养板（Corning®）中，接种培养基为EB形成培养基 + 10 μM Rho-kinase抑制剂（ROCKi）。每隔2天更换为不含ROCKi的EB形成培养基。5天之后，将EBs转移到含有诱导培养基的24孔超低粘附培养板（Corning®）中。对EB培养2天后，使用液体Matrigel®（减少生长因子，Corning®）包被EBs。接下来将它们转移到经过无组织培养处理的6孔板（12-16类器官/孔）中。嵌入的类器官在扩张培养基中维持培养3天。在第10天时，将类器官转换到成熟培养基中，然后放置在RPM为57-95的定轨摇床（Infors HT）上对其进行培养。在成熟培养基中，每3-4天进行换液。在第40天时，类器官进行RT-qPCR分析或冰冻切片后进行免疫染色。EBs形成、诱导和类器官扩张的比例尺 = 300 μm。类器官成熟的比例尺 = 1 mm。

脑类器官培养工具

STEMdiff™脑类器官试剂盒为无血清培养系统，用于从人ES和iPS生成脑类器官。它是基于由Madeline Lancaster和Jürgen Knoblich教授所发布的配方¹。在培养脑类器官时，与那些未经质控的自配试剂相比，该试剂盒显著提升了类器官（包括从难分化的细胞系）形成的效率（图2）。

图2. 与使用未经质控的试剂所生成的脑类器官相比，使用STEMdiff™脑类器官试剂盒生成的脑类器官在质量、产量和标志物表达上的表现都更为优异。

（A）使用STEMdiff™脑类器官试剂盒生成的脑类器官，在第40天发展出厚组织样结构，且直径超过 1 mm。（B）使用未经质控的试剂生成的类器官在第40天并未发育出厚组织，而是形成了较大的含液胞囊。（C）RT-qPCR分析显示，在使用STEMdiff™脑类器官试剂盒所生成的脑类器官中，神经祖细胞与成熟神经元出现上调；（D）对比之下，采用未经质控的试剂生成的类器官显示出较差的神经元标志物表达（平均数 ± SEM，每个细胞系的n = 2；每个分析涉及6个类器官）。数据以18S/TBP为标准，并与未分化的hPSC对照组相比较。（A）和（B）的比例尺 = 1 mm

    已使用脑类器官进行造模的疾病有：

• 小头畸形²

• ZIKA病毒诱导的小头畸形^3-6

• 可卡因的作用⁷

• 自闭症谱系障碍/提摩西综合症⁸

• 阿尔兹海默病⁹

• 小胶质瘤¹⁰

• Miller-Dieker综合症^11-12

　科诺布里奇指出利用胚胎干细胞和诱导性多功能干细胞培育的类器官并没有明显差异。研究人员发现他们培育的类器官具有可变性，一些他们希望研究的大脑区域并未在类器官中出现。兰卡斯特通过使用生长因子(刺激细胞增殖的物质)的方式引导一些类器官内的区域发育。在尝试让迷你大脑生长出更多背侧皮层时，她吃惊地发现人为干预下生长出的背侧皮层数量不及自然发育。兰卡斯特说：“我们认为不同区域之间的‘交流’——类器官不同大脑区域之间的通讯——对每一个个体区域的发育都至关重要。”虽然培育类器官是向前迈进的重要一步，但研究人员距离为中枢神经系统内的神经回路进行建模仍有很长的一段路要走。

参考文献

1. Lancaster M et al. (2014) Nat Protoc 9(10): 2329-40.

2. Lancaster MA et al. (2013). Nature 501(7467): 373-9.

3. Wells MF et al. (2016). Cell Stem Cell 19(6): 703-8.

4. Garcez PP et al. (2016). Science 352(6287): 816-8.

5. Cugola FR et al. (2016). Nature 534(7606): 267-71.

6. Dang J et al. (2016) Cell Stem Cell 19(2): 258-65.

7. Lee CT et al. (2017). Neuropsychopharmacology 42(3): 774-84.

8. Mariana J et al. (2015) Cell 162(2): 375-90.

9. Raja WK et al. (2016) PLoS One 11(9): E0161969.

10. Hubert CG et al. (2016) Cancer Res 76(8): 2465-77.

11. Bershteyn M et al. (2017) Cell Stem Cell 20(4): 435-49.

12. Iefremova V et al. (2017) Cell Rep 19(1): 50-9.

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