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我叫骨头，长得很黑不是我的错，我是新来的NPC，qPCR这种东西吧，我确实还是不熟悉。上次给林师兄跑了一个qPCR，他嫌我用错了程序，什么Taqman不能什么什么熔解。 杀姐姐：小林子说的是所谓的熔解曲线，熔解曲线是SYBR Green法的qPCR过程中较为常见的一种方法。 首先我们来看看什么是SYBR Green法的qPCR，SYBR Green其实和EB差不多，都是结合到双链DNA的小沟中才能发出荧光。就像是这样： PCR的产物都是双链，那在PCR跑完之后，在有SYBR Green的情况下，就会有大量的荧光。但DNA有一个特性，就是在提高温度的时候，会由双链，解链成为单链。这就是说明，DNA在加温变成单链的时候，结合在小沟里的SYBR Green就因为没有地方可以结合，逐渐变少了，于是荧光就下降了。 DNA还有一个特性，就是有一个温度，称之为退火温度，在这个温度下，双链的DNA，会解链一半。为啥要强调解链一半的温度呢，因为当DNA解链一半后，剩下的半条会迅速解链，就会形成这样的熔解曲线中荧光会骤降，形成变化的拐点。 这拐点是有啥意义呢？那就求个导数看看，求导（具体咋求的，估计你也没兴趣知道，也就是Y轴数据前数减后数）后，可以发现突然多了个峰。这就是熔解峰图，峰尖所对应的x轴温度值就是双链DNA的Tm值。 只有一个熔解峰，说明是单一的只有一个产物。但如果有两个产物，长度片段或者碱基不一样的话，就会有两个解链一半时所需要的温度不是么？那就会产生两个熔解峰来，这就是我们通常说的双峰。一旦产生了双峰，就说明你的扩增中有非特异性产物的存在。qPCR的结果是无效的。 由于Taqman所采用的原理不太一样，所以不能用带有熔解曲线的SYBR Green程序来跑qPCR。这就是小林子为啥来数落你的原因啦。这下明白了吧…… 是不是只有SYBR Green才能有熔解曲线呢？呃，其实也不尽然。也有一种比较怪异的熔解曲线，就是利用DNA二级结构可以淬灭荧光基团来做的熔解曲线。一般在引物的5’末端，加上一个荧光基团，然后在扩增完之后，也是逐渐升温，DNA二级结构解链，淬灭能力下降，就会产生一个翻转的熔解曲线。 不过这样的非主流熔解曲线不太常用就是了。好吧，今天就策到这里吧……
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