甜菜碱对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂代谢的影响

探讨甜菜碱对高脂饲料诱导的非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）小鼠肝脏 甘油三酯（triglyceride, TG）水平、病理组织学形态和脂代谢相关基因表达水平的影响。方法 将 72 只雄性 C57BL/6 小鼠随机分为对照组，NAFLD 模型组和 1%甜菜碱干预组，每组 24 只。对照组饲以普通饲料，模型组和干预组均饲 以高脂饲料。对照组和模型组均给予普通的饮用水，干预组给予含 1%甜菜碱的饮用水。干预 12w 和 18w 后，试剂盒 测定肝脏 TG 浓度；肝组织苏木素和伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色观察组织形态学变化；反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测肝组织脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase, FAS）、乙酰辅酶 A 羧化酶 （acetyl-CoA carboxylase, ACC）、脂肪分化相关蛋白（adipose differentiation-related protein, ADRP）、过氧化酶体增殖物 激活 α 受体（peroxisome proliferator-activated receptors α , PPARα ）和微粒体甘油三酯转运蛋白（microsomal triglyceride transfer protein, MTTP） mRNA 表达水平；Western blot 检测肝组织 MTTP 蛋白表达水平。结果 干预 12w 后，与对照 组相比，模型组小鼠肝脏 TG 水平明显上升（P < 0.01），PPARα 和 MTTP mRNA 表达水平明显下降（P < 0.01）；与模 型组相比，1% 甜菜碱干预组小鼠肝脏 TG 水平、ACC 和 ADRP mRNA 表达水平显著下降（均为 P < 0.01），及 PPARα 和 MTTP mRNA 表达水平呈上升趋势（P > 0.05）。干预 18w 后，与对照组相比，模型组小鼠肝脏 TG 水平、FAS、ACC 和 PPARα mRNA 表达水平差异无统计学意义，ADRP 和 MTTP mRNA 表达水平明显下降（均为 P < 0.05）；与模型组 相比，1%甜菜碱干预组小鼠肝脏 TG 水平明显下降（P < 0.01），PPARα 和 MTTP mRNA 表达水平明显增加（均为 P < 0.01）。HE 染色结果显示，干预组脂肪变性较模型组明显减轻。结论 甜菜碱通过调节肝脏脂代谢相关基因的表达，影 响 TG 水平，对高脂饮食诱导 NAFLD 小鼠具有肝损伤保护作用。[营养学报，2014，36（4）：371－376]

关键词： 甜菜碱；非酒精性脂肪；

mRNA 表达；蛋白表达

中图分类号：R151.2

文献标识码：A

文章编号：0512-7955(2014)04-0371-06

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确的损伤 因素之外所致的脂肪肝，以慢性肝细胞大泡性脂 肪变性为主要特征[1]。

肝脏脂质沉积是影响 NAFLD 发生、发展和转归的重要因素[2-3]。 肝脏脂质稳态依赖于甘油三酯（triglyceride，TG）的摄取、从头合成、氧化和转运途径 的动态平衡[4]。乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）是脂肪酸从头合成的关键酶[2] ； 脂肪分化相关蛋白（adipose differentia tionrelated protein, ADRP）介导血浆中的游离脂肪 酸向肝细胞内转移[5-6] ；过氧化物酶体增殖物激活 α 受体（peroxisome proliferator-activated receptors α, PPARα）调控肝细胞中大部分参 与脂肪酸氧化相关基因转录[7]；微粒体甘油三酯 转运蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTTP）参与极低密度脂蛋白（very lowdensity lipoprotein，VLDL）的组装[8]。因此， FAS、ACC、ADRP、PPARα 和 MTTP 等脂质代谢相 关基因的表达异常，促进了 NAFLD 的发生和发展。

甜菜碱（三甲基甘氨酸, B）含有三个活性甲 基，是一种高效的甲基供体。机体的甜菜碱一方 面来源于食物，另一方面胆碱（卵磷脂）在机体 不可逆的氧化代谢产物[9]，因此，甜菜碱可以起 到节约胆碱而可以部分代替胆碱（卵磷脂），而 起到节约胆碱的作用，其防止脂肪肝的作用更受 到高度关注[10]。因此，本研究采用 NAFLD 动物模 型，通过肝脏脂质合成、转运、氧化等途径，从 分子水平深入探讨甜菜碱的作用机制。

1 材 料 与 方 法

1.1 材料

1.1.1 动物：7w 龄雄性 C57BL/6 小鼠，购自广东 省实验动物中心。

1.1.2 试剂：动物基础饲料(D12450B，脂肪供热 比为 10%)和高脂饲料(D12451，脂肪供热比为 45%，加拿大 Research Diets 公司)；甜菜碱（丹 麦 Danisco A/S 公司）；TG 检测试剂盒（普利莱 公司）；HE 染色剂（上海源叶生物科技公司）；逆 转录及荧光定量 PCR 试剂盒（日本 TaKaRa 公司）； 羊抗 MTTP、驴抗羊、羊抗兔多克隆抗体（美国 Santa Cruz 公司）；兔抗 GAPDH 多克隆抗体（美 国 Proteintech 公司）。

1.1.3 仪器：倒置显微镜，CKX41（日本 Olympus 公司）；实时荧光定量 PCR 仪，ABI ViiATM7Dx（美 国 ABI 公司）；双槽式 PCR 扩增仪，PTC-200（美 国 Bio-Rad 公司）；酶标仪，ELX800（美国 Bio-Tek 公司）；垂直板电泳系统，Pac 3000（美国 Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和处理： 7w 龄雄性 C57BL/6 小 鼠 14.5～17.8 g 适应 1w 后，随机分为对照组 （control diet, CD），模型组（high fat diet, HFD）和 1%甜菜碱干预组（ high fat diet 1% betian，HFD B），每组 24 只。其中 CD 组饲以 D12450B 饲料，HFD 组和 HFD B 组均饲以 D12451 饲料。HFD B 组给予含 1%甜菜碱的饮用水，CD 组 和高脂组均给予实验室普通的动物饮用水。所有 动物自由摄食和饮水，每 3 日记录摄食量及饮水 量，每周称量动物体质量。干预 12w 与 18w 后， 各组随机选取 12 只小鼠，眼球取血，取出肝脏并 称重备用。4℃离心分离血清。

1.2.2 血清和肝脏 TG 水平的检测：试剂盒（酶法） 测定血清和肝脏中 TG。以每 g 蛋白浓度校正肝脏 TG 的含量。 营养学报 2014 年第 36 卷第 4 期 373

1.2.3 小鼠肝组织 HE 切片：肝脏标本经 10% 中 性甲醛固定，石蜡包埋并切片；切片脱蜡经 HE 染色后，中性树胶封片；倒置显微镜下观察拍照。 1.2.4 RT-PCR：肝脏组织总 RNA 提取采用 Trizol 一步抽提法，通过逆转录试剂盒逆转录合成 cDNA。PCR 引物由上海英潍捷基公司合成。FAS 上游引物 5'-GCTGCGGAAACTTCAGGAAAT-3'，下引物 5'-AGAGACGTGTCACTCCTGGACTT-3'；ACC 的上 游引物 5'-CACTGTGAACATGTGGAGG-3'，下游引物 5'-AGGCTGATGGTGATGACC-3'；ADRP 的上游引物 5'-AAGAGGCCAAACAAAAGAGCCAGGAGACCA-3'，下游 引物 5'-ACCCTGAATTTTCTGGTTGGCACTGTGCAT-3'； PPARa的上游引物 5'-ATGATCCTCTTGGCAGT GCTT3'，下游引物 5'-GTTGTTGCTGGTCTTTCCCG-3'； MTTP 的上游引物 5'-ATGATCCTCTTGGCAGTGCTT3'，下游引物 5'-TGAGAGGCCAGTTGTGTGAC-3'； β-actin 的 上 游 引 物 5 '-GGGTCAGAAGGATATG-3'，下游引物 5'- GTAACAATGCCATGTTCTCCCAAT-3'。PCR 扩增反应条件为：（1）95℃ 30min， （2）95℃ 5s，（3）60℃ 34s，第（2）（3）步重 复 40 个循环。利用 Applied Biosystems ViiA7 型实时荧光定量 PCR 仪自带软件 ViiA 7 RUO Software1.0 进行相关数据处理, 以 β-actin 为 内参基因，用 2-∆ ∆ Ct法计算基因表达的相对变化。 1.2.5 Western blot：称取 10 mg 肝脏组织，加 入 100 ml 的 RIPA 蛋白裂解液提取蛋白并测定蛋 白浓度。取 42 mg 变性后的蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，电压为 100 V，时间 2 h。蛋白分离后使用 NC 膜进行转膜，电压为 100 V，时间 2 h。转膜 成功后，8%脱脂牛奶的 TBST 溶液室温封闭 2 h。 封闭后的 NC 膜与一抗进行孵育，4℃过夜。一抗 使用含有 1%BSA 的 TBS 溶液稀释：羊抗 MTTP 多克 隆抗体，稀释比 1:200；内参兔抗 GAPDH 多克隆 抗体，稀释比 1:2000。二抗采用驴抗羊多克隆抗 体和羊抗兔多克隆抗体，稀释均为 1:5000，室温， 摇床孵育 2 h，对条带进行检测和曝光。并且使 用 QuantityOne 软件包分析曝光条带的平均光密 度，以目标蛋白/内参蛋白的比值作为表达量进行 半定量分析。

1.3 数据处理

用 SPSS17.0 软件对数据统计，以 x ±s x 表示。 三组之间均数比较采用 One-way Anova，用 LSD-t 检验对两组间进行组间差异分析；P＜0.05 为差 异有统计学意义。

 2 结 果

2.1 对小鼠体重、肝重和肝脏指数的影响（表 1） 干预 12w 和 18w 后，与 CD 组比，HFD 组小鼠 体重明显增加（均为 P＜0.05）；12w 小鼠肝脏指 数呈下降趋势（P＞0.05），18w 小鼠肝脏指数明 显降低（P＜0.05）。HFD B 组小鼠体重、肝重和 肝脏指数与 HFD 组相比，差异无统计学意义。

    2.2 对小鼠血清和肝脏 TG 水平的影响（表 2）

干预 12w 后，与 CD 组比，HFD 组小鼠血清 TG 水平呈上升的趋势，但差异无统计学意义，肝脏 TG 水平明显增加（P＜0.05）；与 HFD 组比，HFD B 组血清和肝脏 TG 水平明显下降，分别为 HFD 组的 50%和 60%（均 P＜0.01）。干预 18w 后，与 HFD 组相比，HFD B 组小鼠血清和肝脏 TG 明显下 降，分别为 HFD 组的 76%和 69%（均为 P＜0.05）。 2.3 对小鼠肝组织病理形态学的影响（图 1）

 光镜下观察，12 w 和 18 w CD 组小鼠肝小叶 结构完整，肝细胞索排列整齐，少见脂肪变性， 细胞结构清晰，胞质丰富，细胞核位于细胞中央， 肝小叶内和血管周围无炎症细胞聚集；HFD 组小鼠肝组织出现了大面积的脂肪变性，部分肝细胞 胞质内充满大脂滴，细胞核被较大的脂滴挤到一 侧；HFD B 组小鼠肝组织脂肪变性较 HFD 组减轻， 胞浆内脂滴数量减少和体积变小。

2.4 对 12w 小鼠肝组织 FAS、ACC、ADRP、PPARa 和 MTTP 表达水平的影响（图 2，3）

与 CD 组比，HFD 组小鼠肝组织 FAS、ACC 和 ADRP mRNA 水平增加，分别为 CD 组的 1.5 倍 （P＜0.05）、1.1 倍和 1.1 倍，PPARa和 MTTP mRNA 水平明显降低，分别为 CD 组的 70%和 75%（均为 P＜0.01）。与 HFD 组相比，HFD B 组小鼠肝组织 FAS、ACC 和 ADRP mRNA 水平降低，分别为 HFD 组的 91%、80%（P＜0.01）和 30%（P＜0.01）， PPARa和 MTTP mRNA 水平呈上升的趋势，但差异 无统计学意义。

HFD 组小鼠肝组织 MTTP 蛋白表达水平为 CD 组的 50%（P＜0.05），HFD B 组肝组织 MTTP 蛋白 表达水平高于 HFD 组，为 HFD 组的 1.2 倍。 2.5 对 18w 小鼠肝组织 FAS、ACC、ADRP、PPARa 和 MTTP 表达水平的影响（图 4，5）

与 CD 组比，HFD 组小鼠肝组织 FAS、ACC 和PPARa mRNA呈上升的趋势，但差异无统计学意义； ADRP 和 MTTP mRNA 明显降低，分别为 CD 组的 45% 和 70%（均为 P＜0.01）。HFD B 组小鼠肝组织 FAS、 ACC 、ADRP、PPARa和 MTTP mRNA 水平高于 HFD 组，分别为 HFD 组的 1.1 倍、1.1 倍、1.2 倍、2.2 倍（P ＜0.01）和 1.5 倍（P ＜0.05）。

HFD 组小鼠肝组织 MTTP 蛋白表达水平为 CD 组 70%（P＜0.05），HFD B 组肝组织 MTTP 蛋白表 达水平高于 HFD 组，为 HFD 组的 1.4 倍（P＜0.05）。

3 讨 论

肝脏脂代谢紊乱是 NAFLD 发生的直接原因。 本实验旨在通过研究甜菜碱对高脂饮食诱导小鼠 肝脏脂代谢相关基因 FAS、ACC、ADRP、PPARa和 MTTP 表达水平的影响，验证甜菜碱在 NAFLD 疾病 进程中对肝脏脂质沉积的影响。结果表明，甜菜 碱对高脂饮食诱导 NAFLD 小鼠具有肝损伤保护作 用：在高脂饮食诱导小鼠 12w 后，甜菜碱主要通 过降低脂肪酸从头合成相关基因 FAS、ACC 和摄取 基因 ADRP mRNA 的表达，减少游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）的输入，降低肝脏 TG 水平； 随着 NAFLD 病程进展（18w），甜菜碱能又通过增 加肝脏中脂肪酸转运基因 MTTP mRNA 的表达，增 加 FFA 的输出，降低肝脏 TG 水平。

     甜菜碱最初作为一种多功能饲料添加剂广 泛应用于猪饲料中，可促进脂质代谢，降低和重 新分配体内脂肪，减少猪体内总体脂肪含量[11] 。 本研究显示，甜菜碱对高脂饮食诱导的 NAFLD 小 鼠体重没有影响，可能是因为体内瘦体质量增加。 越来越多的动物实验和临床实验把甜菜碱作为一 种抗脂肪肝药物，研究其防治脂肪肝作用的细胞 及分子机制[12-15]。此外，在 NAFLD 发生、发展过 程中，甜菜碱干预降低 NAFLD 小鼠血清和肝脏 TG 水平，降低肝脏脂肪变性，延缓疾病的进展，这 归因于肝脏脂质沉积在 NAFLD 早期起主导作用， 而随着 NAFLD 病程进展，早期脂质沉积所引发的 氧化应激、脂质过氧化以及内质网应激是推动 NAFLD 进展的重要因素。

 FAS 和 ACC 是肝脏中脂肪酸从头合成的限速 酶。本研究结果显示，甜菜碱可以降低 FAS 和 ACC mRNA 水平，表明甜菜碱干预可部分降低高脂饮食 诱导的肝脏过多脂肪酸的合成。ADRP 是肝细胞内 脂滴包被蛋白，介导血浆中游离脂肪酸向肝细胞 内转移，参与脂质代谢调控，ADRP 的过表达能刺 激肝脏中脂肪酸的吸收和 TG 形成。ADRP 缺陷小 鼠中肝脏 TG 减少，不易发生脂肪肝[16]。本研究 发现，在 NAFLD 早期（12w），甜菜碱可降低 ADRP mRNA 水平，减少肝脏中 FFA 含量。PPARa是介导 肝脏脂肪酸氧化相关基因表达的关键调节因子， 小鼠 PPARa缺失因脂肪酸氧化障碍这一特点被长 期作为脂肪肝模型[17]，另外，有研究显示，PPARa 拮抗剂可以减轻肝脏脂肪变性[18]。本研究结果显 示，在 NAFLD 早期（12w），HFD 组小鼠 PPARa mRNA 水平下降，甜菜碱增加其表达水平，这表明由甜 菜碱所引发的 PPARa mRNA 水平上调可促进 PPARa 介导的反应途径，而这反应途径恰恰是本高脂饮 食所抑制的。随着 NAFLD 疾病的进展（18w），甜 菜碱同样能增加 PPARa mRNA 表达水平，增加脂 肪酸的氧化消耗。

 MTTP 活性及基因表达水平是控制 VLDL 合成、 装配和分泌速率的关键因素[7] 。有报告显示，MTTP 缺陷会导致 TG 转运活性的降低，从而引起无脂蛋 白血症的发生[19]。与之相一致，Stefano 指出 MTTP 基因表达的下调加剧肝细胞内 TG 的积累，增加患 非酒精性肝炎的易感性[20]。本实验结果表明，在 NAFLD 发生和发展过程中，HFD 组小鼠 MTTP mRNA 和蛋白水平均降低，表明更多的 TG 滞留在肝细胞 内质网中，引发内质网应激，加速 NAFLD 疾病的 进展[21]，甜菜碱干预可升高 MTTP mRNA 及蛋白的 表达水平，增加 TG 的转运。

 [参 考 文 献]

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