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献给科研小白的入门介绍，大牛自动跳过 一、MicroRNA的研究背景 1、MicroRNA简介： （1）microRNA(miRNA) 是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。 （2）在细胞核内转录成前体转录本 (pri-miRNA) （3）被Rnase III 核酸酶 Drosha/pasha加工成约70-90nt的发夹状 pre-miRNA （4）转运到细胞质被Dicer加工成成熟的 miRNA （5）双链 miRNA 分子被解链，单链的miRNA 进入一个核糖蛋白复合体miRNP (RISC，RNA-inducedsilencing complex) （6）通过与靶基因mRNA的3’UTR或者CDS序列配对，促进mRNA的降解或抑制的翻译，从而抑制靶基因的表达。
二、miRNA的发现、功能、分子机制思路 高通量筛选（miRNA微阵列芯片、 miRNA测序） 中低通量定量：miRNA定量qPCR 高通量筛选--------miRNA微阵列芯片：
1、Agilent和Affymetrix 两大miRNA芯片平台简介： Agilent microRNA芯片技术特点： （1）通过特殊的探针设计区分成熟miRNA和miRNA前体； （2）无需分离miRNA，直接用Total RNA进行实验，只需100ng的Total RNA 即可用来进行标记实验； （3）组织、血清、血浆、FFPE、冰冻切片组织、脱落细胞等均可进行实验； （4）高特异性：特殊的专利探针设计能区别一个碱基的差异； （5）高灵敏度：检测丰度跨4个log，最高可达6个log，只要存在6000个拷贝的分子就可以检出； （6）数据来源于Sanger miRBase，并方便及时更新。
2、微阵列芯片技术在microRNA研究中的案例解析 案例1：microRNA芯片筛选发现miR-146a促进肝细胞癌化的内皮细胞血管新生MiR-146a enhancesangiogenic activity of endothelial cells in hepatocellular carcinoma bypromoting PDGFRA expression
复旦大学孙惠川教授与周俭教授研究课题组研究表明，人类miRNA-146a 可以调控血小板衍生生长因子受体(PDGFRA)蛋白的表现，进而促进肝细胞癌化过程之内皮细胞血管新生能力。 研究团队使用Agilent Human microRNA 芯片发现 miRNA-146a 与癌细胞血管新生有关，经由 geneknockdown、gene overexpression 以及动物实验，相互验证 miRNA-146a 确实可以促使内皮细胞之血管新生作用。 研究团队进一步利用人表达谱芯片研究 miRNA-146a 参与血管新生的调控机制，发现 miRNA-146a 是透过抑制BRCA1基因的表现，进而诱导下游AF 相关之PDGFRA 基因的表现，来促进内皮细胞之血管新生作用。miRNA-146a 标靶BRCA1/PDGFRA 的讯息传递机制的厘清，将可为肝癌病患提供一个新的临床治疗标的及平台。
案例2：基因芯片筛选发现肝癌血浆microRNA生物标志物
·复旦大学中山医院肝癌研究所樊嘉教授领衔课题组 ·利用Agilent microRNA芯片筛选、RT-PCR验证等方法在肝癌患者血浆中筛选到了由7个microRNA组成的早期肝癌诊断分子标记物 ·该检测方法对小于2cm的肝癌诊断准确率接近90%，效果优于传统检测方法。
高通量筛选--------miRNA测序 1、miRNA测序技术特点: （1）高灵敏度：理论上可以检测单个细胞中一个拷贝的miRNA； （2）高精度：可以检测miRNA单个碱基的差异； （3）不受先验信息的干扰，既能鉴定已知miRNA，又有能力发 （4）不受先验信息的干扰，既能鉴定已知miRNA，又有能力发现新的miRNA； （5）保留定向信息，用于链特异的表达分析； （6）利用Barcode在单次运行中经济地分析多个样品。
2、二代测序技术在microRNA研究中的案例解析 案例1：水稻miRNA表达谱
（1）共获得94M基因组matched reads，产生超过16M特异的小RNA序列。 （2）参照植物miRNA标准（Meyers, B.C., etal.）评价了406个已知水稻miRNA，发现～150个siRNA-like miRNAs。 （3）发现了76个新的miRNA，预测了356个靶基因，靶基因功能富集在转录因子，信号转导，新陈代谢等方面。 （4）miR-156家族的不同成员除表达丰度有差异外，靶基因也有差异，丰富了转录调控机制。
总结：miRNA研究的验证与功能研究
三、MicroRNA生物标志物 由于miRNA的表达与疾病相关，所以miRNA表达谱可以用来做患者分类，疾病分型和治疗方案的选择。
1、MicroRNA生物标志物案例解析 案例1：肺癌的MicroRNA生物标志物
案例2：胃癌的MicroRNA生物标志物 Uedaet al. Lancet Oncol. (2010)研究了160对胃癌和癌旁组织的miRNA表达谱（miRNA芯片）发现了胃癌不同stage，不同类型及预后的miRNA标志物。 上调的 MIRs，miR-181,miR-21, miR-25, miR-92, miR-19b, miR-17-92, miR-224, miR-19a, miR-345,miR-191, miR-135b, miR-135a 下调的 MIRs，miR-148,miR-375, miR-29b , miR-29c,miR-152, miR-218-2, miR-451, miR-30a-d ,miR-422b 2、研究思路
3、miRNA标志物的样本来源
现在比较常用于miRNA标志物的有：组织，细胞，FFPE样本（福尔马林固定石蜡包埋的方法处理的样本），血清，血浆，唾液，尿液，脑脊液等，来检测不同的疾病，用于诊断，预后或者预测。 （1）肺癌组织miRNA 标志物 相关文献：Two MicroRNA Panels toDiscriminate Three Subtypes of Lung Carcinoma in Bronchial Brushing Specimens.Am J Respir Crit Care Med2012 Dec1;186(11):1160-7. （2）大肠癌组织miRNA 标志物 相关文献：A microRNA panel todiscriminate carcinomas from high-grade intraepithelial neoplasms in colonoscopybiopsy tissue. （3）FFPE miRNA 标志物： 相关文献：miR-29c is downregulated inrenal interstitial fibrosis in humans and rats and restored by HIF-α activation. （4）细胞微粒miRNA 标志物: 相关文献：TLR4 signaling induces therelease of microparticles by tumor cells that regulate inflammatory cytokineIL-6 of macrophages via microRNA let-7b. （5）大肠癌血浆miRNA 标志物 相关文献：A plasma microRNA panel forearly detection of colorectal cancer. （6）鼻咽癌血清miRNA 标志物 相关文献：A four-miRNA signatureidentified from genome-wide serum miRNA profiling predicts survival in patientswith nasopharyngeal carcinoma. （7）唾液样本miRNA 标志物 相关文献：Salivary microRNAs showpotential as a noninvasive biomarker for detecting resectable pancreatic cancer. （8）尿液样本miRNA 标志物 相关文献：Cell-free urinarymicroRNA-99a and microRNA-125b are diagnostic markers for the non-invasivescreening of bladder cancer.
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而这些研究方向参与疾病发生发展过程的分子机制，可以归纳总结为一下几类研究： ②分子拷贝数的表达变化差异； ③RNA分子的剪接加工、出核、细胞组织水平的时空变化研究； ④特殊的一群细胞类型研究、细胞通讯微环境研究； ⑤具有临床应用潜力的新技术（CRIPSR）或者载体（膜结构、细胞等）； ⑥关注细胞生理学现象：自噬、凋亡、线粒体失功等； 相关文章： |
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