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摘要 在酵母双杂交技术的帮助下,研究者揭示并阐明了不少新的蛋白质-蛋白质相互作用,许多先前不明白的调控通路得以明确。双杂交系统利用转录因子(酵母增强子Ga14)的双功能特性,通过报告基因的表达来检测蛋白质相互作用。一旦确认了双杂交相互作用的存在,就可以通过点突变或随机突变让其中一个蛋白质发生突变,使其相互作用的能力下降。用这种策略设计的突变株可以用来研究相互作用的生物学意义,还能用于鉴定相互作用的氨基酸残基。这就是反向双杂交技术。本文介绍的反向杂交方法,可以使大肠杆菌热稳定毒素( Escherichia coli heat- labile toxin,LTA1)的催化亚基产生相互作用缺失的突变,降低与其蛋白质辅助因子——活性状态(GTP-结合)的人ARF3之间的结合能力。 1引言 蛋白质相互作用是细胞内部生化调控网络的关键。在酵母双杂交技术的帮助下,研究者揭示并阐明了不少新的蛋白质-蛋白质相互作用,许多先前不明白的调控通路得以明确。双杂交系统利用转录因子(如Gl4或LexA)的双功能特性检测蛋白质相互作用2。转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域分别表达融合蛋白,但只有在融合蛋白的其他部分具有相互作用时才可以促进转录(见图21-1和注释1)。双杂交文库的筛选已经确认了很多的相互作用蛋白(3、4,而基于蛋白质组的筛选,。也显著增加了可能存在的蛋白相互作用的数目。
 通过双杂交方法确认存在相互作用之后,我们就可以让其中一个蛋白质发生突变,使结合力下降。产生并且应用这种突变体的方法,就是反向双杂交方法。这种相互作用缺损的突变体非常关键,能够用于检测某种特定蛋白质相互作用在活细胞中的功能意义,也可以用来得到一张蛋白质相互作用的功能域图,也可以不依赖内源性蛋白质来制造一些相互作用蛋白质的突变体配对。当目的蛋白质与许多蛋白质相互作用时,这种方法显得尤为有效,因为双杂交筛选可以确定哪些突变体与某一原先相互作用的蛋白质不再发生相互作用,但与其他的蛋白质仍然保持相互作用,即出现特异性相互作用缺失性突变。本文介绍的反向杂交方法,可以使大肠杆菌热不稳定毒素( Escherichia coli heat-labile toxin,LTA)的催化亚基产生相互作用缺失的突变,降低与其活性状态(GTP-结合)的蛋白质辅助因子人ARF3,([Q71L]ARF3)之间的结合能力。 此方法的主要特征包括基于PCR对任一编码区内的特定区域做随机突变,通过免疫印迹技术检测融合蛋白上的标签来确定全长突变体与野生蛋白表达在同一水平。大概是扩增250个碱基对产生一个突变。PCR反应中可以利用调节底物核苷酸浓度或锰离子浓度来控制突变的程度。虽然在突变蛋白质的C-末端融合选择性标签,可用来筛选全长蛋白12,这对于高通量的筛选非常有意义,而且能加速筛选速度—反向双杂交系统限速环节,但我们还是更倾向于应用免疫印迹来估计蛋白的表达和确保表达蛋白质的全长。用下面描述的方法,我们在一周之内就可以得到好几百个B半乳糖苷酶活性降低的菌落,其中一般有25%~50%是由全长蛋白的点突变得来的,具有进一步分析的价值。这样可以得到几十个突变体,可以阐明它们与众多的影响因子之间的作用,并且可以在月之内完成测序。 当数据是阴性结果时,不能等同于相互作用的缺失,这是实验体系中的局限性。然而,与一个蛋白质的相互作用丧失而与其他相关蛋白质仍保持相互作用,这一特点为监测细胞内部活动提供了个有力的手段。另外,让某个蛋白质发生丧失结合力的突变之后,再使其相对结合蛋白质发生突变,就更容易筛选其中恢复结合能力的突变体。这些突变体可以为活细胞的特异性功能提供一些有力的证据。这些突变体可能与野生型蛋白质之间不具有结合能力,可以避免细胞研究中内源性蛋白质带来的干扰或复杂化问题,具有独特的优势。当然,反向双杂交方法得到的数据和结论还可以和其他技术进行交叉印证,从而增强说服力。 2材料 1.pACT2载体(1( Genbank登录号U29899:2g质程择性LEU2基因和ADH1启动子启动表达GaM4p(Gal4p区域(,768~881个氨基酸)激活结构域后面有HA标签序列、插入目的蛋白开放读码框的位点和ADH1终止子。 2. PBG4D载体(:2g带有选择性TRP3基因和Gal4DNA结合结构域的质粒,后面有HA标签,使Gal4-BD可加入任意插入的开放读码框的3’末端,ADH1启动子可促进表达融合蛋白。pBG4D由 Robert M. Brasas从pAsl-CYH质粒亚克隆SacI/Hina片段至D133获得。 3.酵母菌株Y190(MAT(gal4gal80his3tp1-901ade2-101ura3-52 leu2-3, 112+URA3: GAL (UAS)-HIS3cyh)13由 Steve elledge友情提供 4. Whatman滤纸1号。 5.硝化纤维素滤器( Schleicher&. Schuell Protran,82mm)。 6.HA单克隆抗体12CA5( Boehringer),稀释成1:1000(终浓度1pg/m)用于免疫印迹。 7.x-gal:储存浓度为100mg/ml溶解于N,N-二甲基甲酰胺 8.低浓度的dATP核酸混合物:2.5mmol/ L dCTP,2.5mmol/LdGTP,2.5mmol/ L dTTP,0.625mmol/ L dATP,溶于水 9.Taq聚合酶。 10.合成的基本培养基、完全培养基和缺陷培养基。基本培养基(SD):每升1.5g缺乏氨基酸的酵母氮源(Dfco)、20g葡萄糖、5g(NH4)2SO4。完全培养基:每升培养液中加入20m8腺嘌呤、20mg组氨酸、20mg蛋氨酸、20ng色氨酸、20mg尿嘧啶、30mg亮氨酸、30mg赖氨酸,需要缺陷培养基时就把相应的氨基酸去掉,例如SD-Leu-Trp 11.SD琼脂培养基,在SD培养液中每升加入20g琼脂(Dico)。 12.SD-Leu/放线菌酮:SD-Leu含有2.5g/ml的放线菌酮。 13.琼脂糖凝胶和DNA测序设备。 14. SDS- PAGE sodium dodecylsulfate polyacrylamide ge/electrophoresis)和蛋白电转染设备,用于免疫印迹。 15.Z-缓冲液:60mmol/LNa2HPO4,40 mmol/LNaH2PO4,10mmol/L KCl, 2mmol/L MgSO4, pH 7.0 16.PCR诱变所用到的寡聚核苷酸引物: #827(同义引物): GCGTATAACGCGTTTGGAATO,结合pACT2MCS5端的大约70个碱基对。 #828(反义引物): GAGATGGTGCACGATGCACAG,结合pACT2MCS3端的大约70个碱基对 17.测序寡聚核苷酸 #1042(同义引物): GCTTACCCATACGATGTTCCA,结合pACT2MCS的5’端。 #1043(反义引物): TGAACTTGCGGGGTTTTTCAG,结合 PACT2MCS的3端。 18.DNA纯化试剂盒(如: Qiagen小量质粒提取试剂盒、QiaQuick凝胶回收试剂盒、 Wizard pcr纯化试剂盒) 19.pABl57:质粒,通过插入pBG4D的 BamH I位点,能够编码C-末端含有Gal4-BD的[Q7L]ARF3,直接表达[Q7L]ARF3-BD。 20.pX12:质粒,带有E.coli热不稳定毒素(LTA1)催化亚单位(A1)的开放读码框,该读码框克隆到NcoI和 BamH I位点上,与Ga4-AD相连,可以直接表达AD-LTA1(见图21-2)。 21.YAB457:源自Y190的酵母品系,带有pAB157质粒,表达 22.SOS：3.33g/L酵母提取物，6.66g/L葡萄糖，6.66g/L蛋白胨，6.5mmol/L的CaCl2 23. TE: 10mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 Fn lmmol/L EDTA 24.0.1mol/L醋酸锂溶于TE缓冲液。 25. LiOAc/PEG溶液:40%(w/v)PEG3350溶于0.1mol/L醋酸锂TE缓冲液。 26.超声处理过的鲱鱼精子DNA,10mg/ml 27.STES:500mmol/ L NaCl、200mmol/ L Tris-HCl、pH7.6、10mmol/ L EDTA,和1%SDS。 28.酚/氯仿:50%酚50%氯仿 29.氯仿。 30.PCR缓冲液(1×):10 mmol/L
Tris-HCl、pH8.350mmol/LKCl、0.001%凝胶,从10×溶液稀释而成。
 图21-2应用随机PCR突变技术和缺口修复技术产生大量的酵母突变体,以用于反向双杂交的筛选。在扩增pX2质粒编码区LTA1时,在PCR特定突变区域50碱基对外设计引物,以便产生末端与接口处于有缺口质粒样的突变片段,如下面所示。在严格性降低的条件下做PCR,提高了聚合酶的出错率。需要注意的是,DNA的任何区域都可能作为突变靶点。突变的PCR产物和有缺口的pAC2质粒经过限制酶切共转化到酵母菌里,可以通过同源重组实现质粒的修复。当转化到表达[Q7L]ARF3-BD融合蛋白的酵母菌株中时,可以利用菌落β-半乳糖苷酶实验检测转化株相互作用缺失的情况.
(未完，待续)
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