内参 Beta-actin 和 GAPDH 使用的局限性

大部分科研新手接触到的第一个实验就是蛋白免疫印迹 (Western blot e Immunoblotting)。做这个实验最基本的步骤就是内参的选择，但是各位小伙伴有没有想过你为什么要用 Beta-actin，又或者是 GAPDH。我相信你一定听师兄师姐说过“都一样”，“哪个能和目的蛋白分开就用哪个”、要么就是“以前一直用的哪个所以就用哪个”。那么小伙伴你们觉得，真的是这么随意选择的吗？今天我就跟大家一起探讨一下两大内参 Beta-actin 和 GAPDH 使用的局限性。

Beta-actin: 脊椎动物 actin 分为 α、β 和 γ 三种类型，α 型主要表达于心肌和横纹肌细胞中，β 及 γ 型主要表达于非肌细胞中 (这句来自百度百科)。那么 Beta-actin 的局限性具体体现在哪里呢？Angela Dittmer 等人通过使用不同抗体配比浓度 Beta-actin (1:1000, 1:2000, or 1:4000, Cell Signaling #4967) 以及不同的总蛋白质量（3.8 μg、7.5 μg、15 μg）进行实验，结果发现：1:1000 稀释时，三种总蛋白浓度的条带区别不大；而当 1:4000 稀释时，才能看到Beta-actin蛋白表达会随着总蛋白质量的升高而变化（Figure 1）。

之后作者采用不同蛋白质量（0.06 μg、0.12 μg、0.23 μg、0.47μg、0.94 μg、1.88 μg、3.75 μg、7.5 μg）继续进行实验，结果显示，当总蛋白超过一定质量时，Beta-actin 条带的灰度值将不会再随着总蛋白质量的升高而升高。换而言之，你一个样品的总蛋白质量是1.88 μg，另一个样本的总蛋白质量是7.5 μg，结果两个样本的 Beta-actin 条带一摸一样（Figure 2）[1]。怎么样，意不意外，惊不惊喜。

综上所述，Beta-actin 在使用时一定要先进行预实验，从稀释比例和总蛋白上样质量分别验证，才能继续实验。

GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 是糖酵解过程中的一个关键酶，“恒定高表达”使 GAPDH 在 Western 和 PCR 中常作为内参使用。但事实上，所有生物体的细胞都需要 GAPDH 这一关键酶的催化能力，来维持糖酵解这一重要过程。甚至原始古细菌也依赖于 GAPDH 在 Entner-Doudoroff 途径 (又称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸 (KDPG),是细菌的酒精发酵途径) 中的关键作用，这一途径类似糖酵解[2]。说到这里，大家是否明白了，凡是涉及到糖酵解过程变化的实验，都不可以使用 GAPDH 当作内参的，包括糖尿病，衰老等。如果在这些实验中使用了 GAPDH 当作内参，那么就要思考一下，异常的实验结果是不是和内参使用不当有关。

内参的选择绝对不是随意的，必须要根据自己的实验选择最优的内参，下图来自 CST 科研宝典 (CST Guide: Pathways & Protocols)，列举了常用内参选择。 但是大家一定要根据自己的实验进行选择，切记不可随意挑选。当然，如果特别有钱的话，推荐使用 Bio-Rad 的 TGX Stain-Free™ FastCast™ AcrylamideSolutions，进行总蛋白定量，总蛋白定量也是近年来新兴的一种手段，通过直接对每一条泳道的所有蛋白进行总蛋白定量，避免了各种内参的局限性，土豪小伙伴们可以尝试。

  CST Guide:Pathways & Protocols