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【摘要】 目的 探?卡维地洛对非酒精性脂肪肝病（NAFLD）大鼠脂联素表达的影响。方法 40只雄性SD大鼠随机分为对照组（10只）、模型组（10只）和治疗组（20只）。采用高脂饮食建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型， HE染色观察大鼠肝脏病理学变化；应用蛋白质印迹法（Western blot法）检测卡维地洛对非酒精性脂肪肝病大鼠模型肝组织脂联素蛋白表达的影响；应用实时荧光定量PCR技术检测对其mRNA表达的作用。结果 三组病理学检查：①大体形态：对照组肝脏呈鲜红色， 表面光滑有光泽， 边缘规则锐利， 质地软；模型组肝脏体积增大， 边缘变钝， 切面油腻状；治疗组肝脏与模型组相比油腻状减轻， 边缘较清晰， 指压有弹性。②组织学变化：对照组大鼠肝组织切片HE染色肝索排列整齐， 肝细胞无变性坏死， 结构完整；模型组大鼠肝组织切片可见弥漫性肝细胞脂肪变性， 脂质沉积， 空泡变性， 排列紊乱， 局部见纤维组织增生， 汇管区炎症明显；治疗组肝脏病理有不同程度的改善， 轻度至中度脂肪变为主， 肝细胞形态大致正常， 肝内脂肪滴减少。治疗组4周与8周的脂肪变及炎症活动度与模型组相比， 差异具有统计学意义（P<0.05）。模型组大鼠肝组织脂联素表达与对照组相比明显降低， 差异具有统计学意义[（0.59±0.12） VS （1.28±0.11）， t=-13.404， P<0.01]；卡维地洛治疗4周组和8周组脂联素表达明显升高， 与模型组相比差异有统计学意义[（1.24±0.13） VS （0.59±0.12）， t=11.618， P<0.01；（1.39±0.11） VS （0.59±0.12）， t=15.541， P<0.01]。模型组脂联素mRNA表达水平明显低于对照组， 差异具有统计学意义[（0.72±0.06） VS （1.00±0.08）， t=-8.854， P<0.01]；卡维地洛治疗4周组和8周组脂联素mRNA表达明显高于模型组， 差异具有统计学意义[（1.34±0.09） VS （0.72±0.06）， t=18.126， P<0.01；（1.97±0.08） VS （0.72±0.06）， t=39.528， P<0.01]。结论 卡维地洛能明显改善NAFLD大鼠肝脏病变程度， 同时使肝脏表达脂联素升高， 从而为非酒精性脂肪肝病的治疗提供了新的途径。
【关键词】 非酒精性脂肪肝病；卡维地洛；脂联素；大鼠
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.13.109
【Abstract】 Objective To investigate influence by carvedilol on expression of adiponectin in rats with nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods A total of 40 male SD rats were randomly divided into control group （10 rats）， model group （10 rats） and treatment group （20 rats）. Nonalcoholic fatty liver disease rat model was built by high fat diet， and HE staining was applied to observe pathological changes in liver of rats. Western blot method was applied to detect influence by carvedilol on expression of adiponectin in rats with nonalcoholic fatty liver disease. Real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction （PCR） was applied to detect effect for mRNA. Results Pathological examination in the three groups： ① Gross morphology： the control group had bright red liver with smooth and glossy surface， regular and sharp edge and soft texture. The model group had enlarged liver， with blunt edge and oleaginous section. The treatment group had slighter oleaginous section and clearer edge， with elasticity. ② Histological change： the control group had regular hepatic cords in HE staining of liver tissue slice with no degenerative necrosis in liver cell and complete structure. The model group had diffuse hepatic cell fatty degeneration in liver tissue slice， with lipidosis， vacuolar degeneration， disorder arrangement， local proliferation of fibrous tissue， and obvious portal area inflammation. The treatment group had different degree of improvement in liver pathology， with mainly mild and moderate fatty change， normal liver cellular morphology， and reduction of intrahepatic fat granule. Comparison of fatty change and inflammation grade between the treatment group and the model group showed statistically significant difference （P<0.05）. The model group had obviously lower expression of adiponectin in liver tissue than the control group in 4 weeks and 8 weeks of treatment， and their difference had statistical significance [（0.59±0.12） VS （1.28±0.11）， t=-13.404， P<0.01]. In 4 weeks and 8 weeks of treatment by carvedilol， the treatment group had obviously higher expression of adiponectin. Comparing with the model group， their difference had statistical significance [（1.24±0.13） VS （0.59±0.12）， t=11.618， P<0.01； （1.39±0.11） VS （0.59±0.12）， t=15.541， P<0.01]. The model group had much lower expression of adiponectin mRNA than the control group， and the difference had statistical significance [（0.72±0.06） VS （1.00±0.08）， t=-8.854， P<0.01]. In 4 weeks and 8 weeks of treatment by carvedilol， the treatment group had obviously higher expression of adiponectin mRNA than the model group， and the difference had statistical significance [（1.34±0.09） VS （0.72±0.06）， t=18.126， P<0.01； （1.97±0.08） VS （0.72±0.06）， t=39.528， P<0.01]. Conclusion Carvedilol can remarkably improve liver lesion degree in NAFLD rats， along with increased expression of adiponectin in liver. It provides a new pathway in treating nonalcoholic fatty liver disease. 【Key words】 Nonalcoholic fatty liver disease； Carvedilol； Adiponectin； Rats
非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD） 是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征， 目前尚缺乏防治NAFLD的有效措施。非酒精性脂肪肝病患者血清脂联素水平降低， 并且有可能受交感神经递质的参与调节[1]。卡维地洛为肾上腺素α、β受体阻断剂， 阻断受体的同时具有舒张血管作用。卡维地洛是否可以影响NAFLD大鼠肝组织脂联素的表达， 进而影响NAFLD的疾病进展仍不明确。本研究通过检测卡维地洛对NAFLD大鼠肝组织脂联素表达的影响， 进而为NAFLD的治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试剂与药物 卡维地洛片剂购自上海罗氏制药有限公司（批号MH6282603）；兔抗人脂联素抗体和兔抗人β-Actin抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；RNA提取TRIZOL试剂盒为罗氏公司（ROCHE）产品；逆转录反应体系、SYBR Green RealMasterMix购自北京天根公司；Taq 酶、 DNaseI 购自宝生物公司（TaKaRa）， 其余均为国产分析纯试剂。所用PCR引物由威斯腾生物技术公司合成。
1. 2 实验动物分组以及模型制备 SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠40只（购于河北省人民医院实验动物中心）， 体质量180～200 g。随机分为对照组（10只）、模型组（10只）、治疗组（20只）。对照组给予基础饲料喂养；模型组和治疗组大鼠均给予高脂饲料（88%基础饲料+2%胆固醇+10%猪油）喂养， 自由进食水[2]， 第4、8、12周各处死1只模型组大鼠做肝脏病理HE染色， 以判断造模情况。卡维地洛片用生理盐水配置成浓度为25 mg/dl 的药液， 结合预实验情况， 给予造模成功的治疗组大鼠1 mg/（kg?d）分2次灌胃， 分别干预4、8周；对照组及模型组同时灌等量蒸馏水。遵循中国科学技术委员会制定的《实验动物管理条例》进行实验操作。
1. 3 标本处理 麻醉动物后结扎剪断肝门管道系统， 取出大鼠肝脏， 冲洗后置于无菌培养皿中。①切取肝左叶约1 mm×1 mm×1 mm组织3块， 4%戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后， 置于无菌冻存管液氮冰冻保存。
1. 4 方法
1. 4. 1 组织病理学检测 肝组织石蜡包埋， 切片后行常规HE染色， 在光学显微镜下观察肝脏病理学改变， 每张切片随机观察10个视野， 根据Diehl法进行肝细胞脂肪变性程度分级[3]。根据Knodell提出的慢性肝炎组织学活动指数（histological activity index， HAI）进行炎症活动度计分。
1. 4. 2 Western blot检测脂联素蛋白的变化 提取肝组织总蛋白， 考马斯亮蓝比色法测定蛋白含量。聚丙烯胺凝胶（10% 分离胶和4% 浓缩胶）电泳， 60伏恒压转膜2 h， 分别以兔抗人脂联素抗体（1∶200）和兔抗人β-Actin多克隆抗体（1：200）作为第一抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（1∶5000）作为第二抗体进行反应， 超敏发光液显影；将胶片进行扫描， 用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
1. 4. 3 Real-time Q-PCR检测卡维地洛对肝组织表达脂联素的影响 ①按照TRIZOL Reagent 液说明书提取总RNA， 然后用紫外分光光度计定量。按照试剂盒说明书进行 cDNA的逆转录。总 RNA 经 RT反应后进行PCR扩增；脂联素及内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）引物利用Primer Premier 5 软件自行设计， 序列通过BLAST进行比对具有特异性， 引物合成由威斯腾生物技术公司完成。具体如下：脂联素（上游引物：5′-AATCCTGCCCAGTCATGAAG-3′， 下游引物：5′- CATCTCCTGGGTCACCCTTA -3′， 扩增片段362 bp）。GAPDH（上游引物：5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′， 下游引物为 5′-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3′， 扩增片段 499 bp）。②在PE5700实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增。SYBR反应体系25 μl：2.5×RealMasterMix 10 μl， 20×SYBR solution 1.25 μl， 上游引物 0.5 μl， 下游引物 0.5 μl， DNA模板2 μl， 不足用DEPC水补齐。反应条件为：95℃预变性 5 min， 95℃ 30 s， 59℃ 40 s， 72℃ 1 min， 30 次循环， 72℃延伸 10 min。采用实时荧光定量PCR仪相应软件程序记录、分析检测数据。
1. 5 统计?W方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 肝脏组织病理学检查 ①大体形态：对照组肝脏呈鲜红色， 表面光滑有光泽， 边缘规则锐利， 质地软；模型组肝脏体积增大， 边缘变钝， 切面油腻状；治疗组肝脏与模型组相比油腻状减轻， 边缘较清晰， 指压有弹性。②组织学变化：对照组大鼠肝组织切片HE染色肝索排列整齐， 肝细胞无变性坏死， 结构完整；模型组大鼠肝组织切片可见弥漫性肝细胞脂肪变性， 脂质沉积， 空泡变性， 排列紊乱， 局部见纤维组织增生， 汇管区炎症明显；治疗组肝脏病理有不同程度的改善， 轻度至中度脂肪变为主， 肝细胞形态大致正常， 肝内脂肪滴减少。治疗组4周与8周的脂肪变及炎症活动度与模型组相比， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1， 图1。 2. 2 Western blot 检测脂联素蛋白的变化 模型组大鼠肝组织脂联素表达与对照组相比明显降低， 差异具有统计学意义[（0.59±0.12） VS （1.28±0.11）， t=-13.404， P<0.01]， 卡维地洛治疗4周组和8周组脂联素表达明显升高， 与模型组相比差异有统计学意义[（1.24±0.13） VS （0.59±0.12）， t=11.618， P<0.01；（1.39±0.11） VS （0.59±0.12）， t=15.541， P<0.01]。见表2， 图2。
2. 3 Real-time Q-PCR检测卡维地洛对肝组织表达脂联素的影响 在PCR扩增的指数时期， 模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系， 故应用2-△△Ct法比较各组肝组织中的脂联素mRNA的表达情况。结果证实， 模型组脂联素mRNA表达水平明显低于对照组， 差异具有统计学意义[（0.72±0.06） VS（1.00±0.08）， t=-8.854， P<0.01]；卡维地洛治疗4周组和8周组脂联素mRNA表达明显高于模型组， 差异具有统计学意义[（1.34±0.09） VS （0.72±0.06），t=18.126， P<0.01；（1.97±0.08） VS （0.72±0.06）， t=39.528， P<0.01]。?表3， 图3。
3 讨论
非酒精性脂肪肝病是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征， 与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤[4， 5]。包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎及其相关肝硬化。近年来， 随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势， NAFLD的发病率呈明显上升趋势。脂肪组织不仅参与能量代谢， 还能以内分泌、旁分泌和自分泌的形式分泌大量脂肪因子， 包括瘦素（leptin）、脂联素（adiponectin， APN）、抵抗素、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）α、白细胞介素6（IL-6）、纤溶酶原激活剂抑制物、胰岛素样生长因子1等 [6， 7]。研究发现， 脂联素参与了脂肪肝、肝炎、肝纤维化及肝硬化等慢性肝病的发生和发展， 已经成为肝病研究领域的热点[8， 9]。非酒精性脂肪肝病患者血清瘦素水平明显升高， 目前认为是NAFLD患者普遍存在胰岛素抵抗和（或）瘦素抵抗所致[10]。脂联素是一种胰岛素增敏激素， 能改善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症， 是机体脂肪代谢和血清稳态调控网络的重要调节因子。对人体的研究发现， 脂联素水平能预示2型糖尿病和冠心病的发展。肝病领域研究发现， 酒精性脂肪肝病大鼠脂联素水平降低， 这有可能是肝脏疾病进展的重要标志 [11]。而血清脂联素水平升高， 则可能有利于 NAFLD 的控制。
交感神经系统的过度活化已经证实参与了肝脏疾病的发生和发展[12， 13]。而脂联素作为肝脏的调节因子， 对肝脏的作用也需要交感神经递质的参与[14， 15]。新一代肾上腺素受体阻滞剂卡维地洛阻断受体的同时还具有外周扩血管作用[16]。近年来， 卡维地洛在非酒精性脂肪肝病方面的研究也屡见报道。作者前期研究发现， 卡维地洛能明显改善实验性大鼠肝纤维化程度， 同时下调大鼠肝脏中瘦素以及瘦素受体的水平[17]。在本研究中三组病理学检查：①大体形态：对照组肝脏呈鲜红色， 表面光滑有光泽， 边缘规则锐利， 质地软；模型组肝脏体积增大， 边缘变钝， 切面油腻状；治疗组肝脏与模型组相比油腻状减轻， 边缘较清晰， 指压有弹性。②组织学变化：对照组大鼠肝组织切片HE染色肝索排列整齐， 肝细胞无变性坏死， 结构完整；模型组大鼠肝组织切片可见弥漫性肝细胞脂肪变性， 脂质沉积， 空泡变性， 排列紊乱， 局部见纤维组织增生， 汇管区炎症明显；治疗组肝脏病理有不同程度的改善， 轻度至中度脂肪变为主， 肝细胞形态大致正常， 肝内脂肪滴减少。治疗组4周与8周的脂肪变及炎症活动度与模型组相比， 差异具有统计学意义（P<0.05）。模型组大鼠肝组织脂联素表达与对照组相比明显降低， 差异具有统计学意义[（0.59±0.12） VS （1.28±0.11）， t=-13.404， P<0.01]；卡维地洛治疗4周组和8周组脂联素表达明显升高， 与模型组相比差异有统计学意义[（1.24±0.13） VS （0.59±0.12）， t=11.618， P<0.01；（1.39±0.11） VS （0.59±0.12）， t=15.541， P<0.01]。模型组脂联素mRNA表达水平明显低于对照组， 差异具有统计学意义[（0.72±0.06） VS （1.00±0.08）， t=-8.854， P<0.01]；卡维地洛治疗4周组和8周组脂联素mRNA表达明显高于模型组， 差异具有统计学意义[（1.34±0.09） VS （0.72±0.06）， t=18.126， P<0.01；（1.97±0.08） VS （0.72±0.06）， t=39.528， P<0.01]。证实， 应用高脂饮食法成功建立大鼠NAFLD动物模型， 模型组大鼠肝组织脂联素蛋白及mRNA 表达均明显减少， 说明脂联素表达确实参与了大鼠肝脏脂肪变进程。给予脂肪肝大鼠卡维地洛治疗后， 大鼠脂肪变程度减轻， 病理分级明显改善， 说明卡维地洛可以改善NAFLD的肝脏病变程度， 进一步证实交感神经系统确实参与了NAFLD疾病的进展。卡维地洛治疗后， 肝组织脂联素表达水平升高， 肝脏病变减轻， 可能是由于卡维地洛通过交感神经阻滞作用， 从而干预了脂联素的表达， 具体调节机制尚需要进一步的探讨， 以便为临床上非酒精性脂肪肝病的治疗提供新的途径。
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[收稿日期：2017-02-28]
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