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LC/MS-based metabolomics strategy to assess the amelioration effects of ginseng total saponins on memory deficiency induced by simulated microgravity 基于LC/ MS代谢组学评价人参总皂苷对模拟微重力所导致记忆缺失的改善作用 期刊：Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，IF=3.24 发表时间：2016.4.1 01 研究背景 微重力(MG)会引起大脑的变化，这可能是人类和实验动物许多记忆障碍的根本原因。微重力(MG)可阻碍海马神经发生，改变脑基因和蛋白(如神经肽)的表达，导致感觉运动皮层树突棘的重塑，改变海马CA1神经元的形态。 人参，即人参的根和根茎，是一种非常著名的中药，具有多种生物活性，包括益智作用。皂苷被认为是其主要活性成分。由于其活性成分的复杂性，其改善记忆的确切机制仍不清楚。到目前为止，研究主要集中在人参总皂苷(GTS)改善作用中发生的生化和病理变化，而很少有研究检测GTS治疗后代谢产物谱的变化，也很少有研究GTS如何通过调节代谢发挥记忆改善作用。新出现的代谢组学为研究人参皂苷益智作用的分子机制提供了新的视角。 本研究首次采用代谢组学方法评价MG对模拟微重力后肢卸载大鼠的记忆影响及GTS对记忆改善的作用。 研究材料： 1）5年生人参根和根茎 2）大鼠血浆和海马样本。 主要技术平台：LC-MS 02 方案设计 1.在人参根和根茎中提取GTS，采用超高效液相色谱紫外分光光度法测定了人参皂苷Rg1(6.13)、Re(3.45)、Rf(1.60)、Rb1(15.36)、Rc(5.81)、Rb2(5.54)、Rb3(0.50)、Rd(2.45)等8种主要人参皂苷的含量(g/100g GTS)； 2.雄性大鼠随机分为6组(每组n = 8)，其中代谢组学评价采用3组，即代谢组学研究对照组(MC)、代谢组学研究HU组(MH)、代谢组学研究HU+GTS治疗组(MHG)；另外3组进行行为评价，包括行为研究对照组(BC)、行为研究HU组(BH)、行为研究HU + GTS治疗组(BHG)。其中MH、MHG、BH、BHG组大鼠尾悬吊7天，MC组和BC组的大鼠接受了类似的治疗，但它们的尾巴没有悬空。7天内，MHG、BHG大鼠每天口服GTS (100mg /kg体重)生理盐水1次，其余各组大鼠口服等量生理盐水。实验后，取其血浆和海马进行代谢检测。 03 研究结果 1.UHPLC-QTOF-MS代谢物鉴定 通过对6个重复制备的QC样品和6个平行制备的QC样品进行分析，对仪器稳定性和测定重复性进行评价。选取8个不同质荷比(m/z)和保留时间(min)的随机提取色谱峰进行LC-MS法验证。 UHPLC-QTOF-MS代表血浆和海马样品的碱性峰离子(BPI)色谱图如图S1所示。可以看出，UHPLC系统的高性能和HSS T3柱填料的粒径小(1.8 µm)，使得小分子代谢产物能够在13 min的短洗脱时间内得到很好的分离。  图S1.大鼠血浆(A,B,C)和海马(D,E,F)样本中提取的色谱图，分别为MC(A,D)、MH(B,E)和MHG(C,F) 2.多元统计分析 PCA评分图(图1)显示，MC与MH组的分离程度明显高于MC与MHG组，说明GTS可以减轻HU诱导的代谢物干扰。  图1. 不同组血浆(A)和海马(B)代谢物PCA分析 PLS-DA评分图(图2A和图2C)显示，三组间的分离更为显著，GTS可以将HU诱导的代谢谱变化恢复到正常方向。从负载图(图2B和图2D)可以看出，不同的代谢物负责三组之间的分离，因此被认为是潜在的生物标志物。  图2. 不同组的血浆(A和B)和海马(C和D)代谢物PLS-DA得分图(A和C)和载荷图(B和D) 非靶代谢组学鉴定的潜在生物标志物见表1和表2。可见，GTS主要通过调节NTs的生物合成和氨基酸、脂肪酸、鞘脂类、嘌呤和嘧啶、磷脂的代谢来发挥记忆改善作用。 表1.PLS-DA模型在MC、MH、MHG组中鉴定的血浆生物标志物  表2.PLS-DA模型在MC、MH、MHG组中鉴定的海马生物标志物  3.靶向代谢物鉴定 对45个检测的代谢物进行峰图积分校正，并进行方差分析。根据临界值(p <>  图3. UFLC-MS/MS分析发现血浆(A)和海马(B)样本潜在生物标志物 4.神经递质分析 从表3可知，HU可以导致海马NTs的广泛变异。8例NTs中谷氨酸（Glu）、5-羟色胺（血清素，5-HT）上调，乙酰胆碱（Ach）、高香草酸（HVA）、多巴胺（DA）、肾上腺素（E）、伽马氨基丁酸（GABA）下调。GTS可以纠正大部分受影响NTs的干扰，尤其是Glu、Ach和HVA。 表3.大鼠海马MC、MH、MHG中NTs的含量  氨基酸（Glu，Trp，Asn，Asp）和酪氨酸（Tyr）高度相关的神经传递素生物合成和记忆功能。此外，Asn，Asp，Phe和Tyr的变化趋势相同，在血浆和海马中均有发现(图4)，HU大鼠海马Trp降低。Trp是5-HT的生物合成前体，与记忆能力密切相关。 研究发现，Trp的耗竭会导致陈述性记忆巩固的损害。人参皂苷Rg1和Rb1可以纠正AD小鼠Trp水平的下降。Phe是Tyr的前体，而Tyr是DA、E、NE、黑色素的前体。苯丙氨酸和酪氨酸的消耗会损害空间工作记忆。仔细观察Trp与Tyr的代谢途径(图5)，发现Trp与Tyr具有相同的生物合成前体。结果表明，Asp是NMDA受体的弱激动剂。Asp和Asn是大脑发育和功能所必需的。  图4.在血浆(A)和海马(B)样本中发现的与HU诱导的记忆缺失和GTS改善高度相关的生物标志物 NTs是神经传导的介质，在正常记忆功能中起着关键作用。NTs水平的降低或增加可能会影响记忆。 在本研究中，HU导致海马NTs的广泛失衡，而GTS可以纠正这些变化中的大部分。Glu是记忆中最重要的兴奋性NT。然而，过高水平的Glu也可以通过过度激活谷氨酸受体而成为一种神经毒素，并通过引起细胞内钙超载而发挥兴奋毒性。Glu由HU上调，GTS恢复。通过抑制过度激活的NMDA受体来发挥GTS的神经保护作用。乙酰胆碱对可塑性、觉醒、奖励、感知和持续注意力有多种影响。脑内胆碱能(产生乙酰胆碱)系统的损伤已被证明与一系列记忆障碍有关。DA和E是儿茶酚胺和正常记忆的重要介质，脑儿茶酚胺的消耗严重影响记忆能力。 人参皂苷Rg1和Re可保护MPTP诱导的多巴胺能神经元损失。GABA是Glu的代谢产物，是大脑中主要的抑制性NT(图5)，GABA受体激动剂一般会损害记忆，而其拮抗剂则促进记忆。在后肢未负重大鼠中，躯体感觉细胞GABA水平降低。  图5.受HU影响的主要代谢途径。绿色表示下调;红色表示上调;(+)表示激活 5.潜在标志物的解析 识别出潜在标志物的聚类热图根据其相对强度呈现出一定的聚类趋势(图S2)。  图S2.潜在生物标志物的热图和树状图可视化。A：血浆样本；B：海马样本 相关分析显示，酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）等生物标志物具有高度相关性(图S3和图6)。  图S3.血浆(A)和海马(B)潜在生物标志物相关性矩阵图 图6.海马标本酪氨酸和色氨酸(A)的相关性及其变化趋势(B) 6.PA试验，CORT水平，Nissl染色 被动回避（PA，passive avoidance）是一项依赖海马的任务。在这项任务中，大鼠必须学习条件刺激(如光)和非条件刺激(如足震)之间的联系。本研究中，主动回避次数明显减少，回避失败次数明显增加，说明BH大鼠的记忆能力受到严重损害。GTS可以提高主动回避反应的赤字反映通过增加活动避免和减少的数量避免失败(图7)。 图7.大鼠在被动回避试验中的表现 A：主动回避的次数；B：回避失败次数 采用ELISA试剂盒测定血浆CORT水平。本研究观察了高水平CORT诱导的海马神经元损伤及GTS对高水平CORT的抑制作用。抑制CORT水平升高可能是人参皂苷增强记忆的机制之一。 尼氏体是神经元的亚细胞结构之一，NT所需的酶等蛋白质合成是其主要的生物学功能。在正常生理条件下，尼氏体数量较多，甲苯胺蓝染色较暗(图8A)，说明尼氏体蛋白合成功能较强。然而，在受损神经元中，尼氏体的数量会减少甚至消失(图8B)。本研究观察人参皂苷对海马神经元的保护作用(图8C)。从Nissl染色结果(图8)可以看出，GTS能明显减轻HU诱导的海马神经元损伤。 图8.海马CA1锥体神经元Nissl染色 A：正常锥体神经元(核深染)；B：HU(核淡染)致神经元损伤；C：GTS保护神经元免受损伤 04 研究创新点 1.基于非靶+靶向代谢组检测技术，分析不同处理大鼠代谢组差异，筛选生物标志物。 2. 结合被动回避模型及神经元Nissl染色等技术，研究人参总皂苷对模拟微重力所导致记忆缺失的改善作用。 05 文章延伸 1.代谢物是生物体表型的基础与直接体现，能够帮助我们更直观有效地了解生物学过程及其机理。植物代谢组的研究对理解植物代谢途径，调控果实采后贮藏条件及贮藏保质期，提高其品质有着非常重要的作用。 2. 代谢组是基因组与表型组的桥梁。代谢物的种类和数量在不同品种与时期阶段都有差异，利用这些差异进行遗传基础的解析将有助于我们深入了解代谢生物学过程。 系统生物学研究内容 3. 广泛靶向代谢组（Widely-targeted metabolome）——创新的高通量代谢组检测技术。生物体需要产生结构多样、功能特异的代谢物以抵御外界多变的环境，其中植物中代谢物多大100多万种。因此，一种高通量的代谢物检测技术成为研究代谢组的必备利器。迈维代谢创新了广靶技术，可以高通量、高灵敏、广覆盖检测不同材料中的代谢物。 广泛靶向代谢组检测技术比较 迈维代谢 武汉迈特维尔生物科技有限公司（简称“迈维代谢”）位于武汉国家生物产业基地--光谷生物城，专注于提供领先的代谢组学技术开发及服务。迈维代谢创新了“广泛靶向代谢组”技术，基于“代谢组+基因组+转录组”多组学研究方案，近年来以通讯作者身份在Cell、Nature Communications 、Nature Genetics 、PNAS等国际学术期刊发表多篇论文，引领基因组时代的代谢生物学研究新方向。 |
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