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前段时间接到老板给的任务，让我探索一下端粒长度的测量。我本来推荐用Southern来测，后来由于缺少实验仪器，就重新选择了QPCR法来测，我之前从来没有做过QPCR所以看文献总觉的一知半解，懂得不够彻底，所以静下心来花了一个星期仔仔细细的看了一篇文献，顺带翻译整理出来了。想着发到论坛上来，说不定能帮到需要的同学 翻译的不好，请多多指教。 英文原文在附件中，不需要叮当就可以下载。 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 关于成年人健康与衰老的流行病学研究（GERA）队列中的100000个受试者的端粒长度的测量和信息学自动化分析
摘要 Kaiser Permanente地区的基因、环境和健康研究计划（RPGEH）包括成年人健康与衰老的流行病学研究（GERA）队列中的110266个人的唾液DNA提取样本。由于其与衰老的关系，端粒长度的测量被认为是发展这些主题的重要的生物标记物。为了在短时期内分析这个大群体的相对端粒长度，我们开发了一个全新的高通量机器人系统用来进行端粒长度测量和信息学分析。检测样本以随机的方式与对照样本一起运行三次。作为质量控制的一部分，我们规定了样本内变异率并采用阈值来消除测量偏差。在106902份样本的分析结果中，105539份(98.7%)通过了所有的质控检测。正如预期的那样，端粒长度总体上表现出随着年龄的增长而下降，并且性别不同下降不同。尽管在75岁以前，端粒与年龄表现出负相关，但在超过75岁以后，年龄与更长的端粒呈正相关，预示着在75岁以上的个体中，更长的端粒与更多的生存年数有关。此外，虽然女性通常比男性拥有更长的端粒，但这种差异仅对50以上的人才有意义。另一个新的发现是个体间端粒长度的差异随着年龄增加而增加。这项研究建立了可靠的检测和分析方法，用于测量大规模人群的端粒长度。GERA队列代表了当前最大的链接到全面电子健康和基因型数据库可用来分析的资源。
关键词：relative telomere length; GERA cohort; saliva DNA; robotic assay; quantitative PCR
端粒是覆盖在真核生物染色体末端具有保护作用的DNA-蛋白复合物，是基因组稳定所必须的。基本的端粒DNA由一段简单的串联重复序列组成，通过高度调控反转录酶——细胞端粒酶的活性来维持端粒长度。端粒DNA易受一系列自然终端侵蚀进程的影响，包括线性染色体DNA的末端复制问题，这导致体细胞每次分裂时端粒变短(Olovnikov 1973; Blackburn 2005),还有细胞内其他进程也导致端粒长度缩短，包括核酸酶的作用，复制叉停止通过端粒DNA重复区域，DNA重组以及氧化损伤(Jain and Cooper 2010)。尽管端粒酶可以通过延长和保护端粒来抵抗缩短，但端粒酶活性在正常细胞中通常是下调的(Blackburn 1997)。当端粒变得太短时，细胞变得衰老，失去了分裂能力和正常的功能(Allsopp et al. 1992; Blackburn 2000; Armanios and Blackburn 2012)。在人类中减少端粒酶并导致短端粒的突变引起一系列的早发性疾病和状况，统称为“端粒综合征”，其具有许多人群中常见的衰老疾病的共同特征 (Armanios and Blackburn 2012)。多个独立的研究发现，受损的人类端粒DNA长度的维持，与广泛的疾病和一些年龄相关疾病有关，以预测未来的风险和预后，包括死亡率。(Von Zglinicki et al. 2000; Samani et al. 2001; Cawthon et al. 2003; Panossian et al. 2003; Valdes et al. 2005; Bischoff et al. 2006; Harris et al. 2006; Martin- Ruiz et al. 2006; Bakaysa et al. 2007; Brouilette et al. 2007; Fitzpatrick et al. 2007, 2011; Aubert and Lansdorp 2008; Farzaneh-Far et al. 2008; Kimura et al. 2008; Epel et al. 2009; Njajou et al. 2009; Astrup et al. 2010; Codd et al. 2010, 2013; Salpea et al. 2010; Willeit et al. 2010a,b; Zee et al. 2010; Strandberg et al. 2011; Wentzensen et al. 2011; Yaffe et al. 2011; Honig et al. 2012; Lee et al. 2012; Weischer et al. 2012; Bojesen 2013; Muezzinler et al. 2013; Gardner et al. 2014; Haycock et al. 2014; Walsh et al. 2014)。
大多数将端粒长度与人类临床和其他状态相关联的研究，都是通过测量血液白细胞端粒长度（通常是外周血单核细胞PBMC或白细胞）来进行的，使用Southern印迹或经证实与Southern印迹测量具有强一致性的经充分验证的基于PCR的方法(Aviv et al. 2011)。在多个独立队列研究中，外周血白细胞或者白血球样本中的端粒长度与性别相关（女性较长），与年龄呈负相关（Muezzinler et al. 2013; Gardner et al. 2014）。最近，一项整合了自1992-2002年间全国健康和营养检测调查数据（一个大的，全国性的有代表性的，人种和社会经济地位不同的样本）的研究指出，性别、人种种族和社会经济地位（SES）缓和了端粒长度与老年人的死亡率之间的关系(Needham et al. 2012)。然而，虽然在一些人群队列的研究发现较短的外周血单核细胞端粒长度或白细胞端粒长度与死亡率增加相关(Cawthon et al. 2003; Martin-Ruiz et al. 2006; Bakaysa et al. 2007; Farzaneh-Far et al. 2008; Kimura et al. 2008; Epel et al. 2009; Astrup et al. 2010; Willeit et al. 2010b; Fitzpatrick et al. 2011; Honig et al. 2012; Lee et al. 2012; Weischer et al. 2012)，但在其他人的研究中却没有发现(Bischoff et al. 2006; Harris et al. 2006; Njajou et al. 2009; Strandberg et al. 2011)。文献中的这些不一致可能是由于研究队列、样本量、分析方法和其他方法学的不同造成的（Bojesen 2013）。
众所周知，平均端粒长度受细胞类型特异性和系统性共同控制。具体而言，在血液白细胞中观察到了不同细胞亚型平均端粒长度的不同 (Lin et al. 2010)。因此，在同一个个体中，粒细胞和B淋巴细胞的平均端粒长度通常比T淋巴细胞的长，并且相应的，CD4+和CD8+CD28+T淋巴细胞具有比CD8+CD28- T细胞更长的平均端粒长度(Lin et al. 2010)。然而，不同个体之间的比较，所有这些细胞类型的平均端粒长度也在任何给定个体中一致地上下浮动，这表明除了细胞类型不同之外端粒长度还有系统性的调节。通过分析表明，不同细胞间存在的端粒长度差异的系统性影响进一步增强，外周血单核细胞或白血球的平均端粒长度与口腔细胞或成纤维细胞的端粒长度相比，个体内的相关性比个体间的相关性更大(Graakjaer et al. 2006; Gadalla et al. 2010)。
在这里，我们描述了一种全新的自动化高通量检测和分析方法，用于测量来自北加利福尼亚Kaiser Permanente （KPNC）地区的基因、环境和健康研究计划（RPGEH）的成年人健康与衰老的流行病学研究（GERA）队列中的大于100000个人类受试者的细胞衍生自唾液样本的平均端粒长度。由于高达74%的唾液中的DNA来源于白细胞（Thiede et al.2000），我们预计从唾液样本中获得的结果将表现出与血液来源的DNA相当的特征。评估这个猜想的一种方法是用我们使用唾液DNA获得的结果与前人的研究结果进行比较，其使用从抽血样本制备的白细胞或外周血单核细胞来研究端粒长度和人口统计学参数（年龄、性别）之间的关系。
作为KPNC健康计划的成员，GERA队列成员可获得广泛的电子健康数据，包含诊断、实验室检查、病理报告以及其他临床评估，这些数据可以用来分析与测量到的端粒长度之间的关系。这也代表了可得到的端粒长度测量的最大单一队列。
材料和方法 研究对象 GERA队列由KPNC健康计划的110266名成年男性和女性成员组成。它是KPNC研究计划关于基因、环境和健康（RPGEH）的一部分。队列和研究设计的详细描述可以在基因型和表型数据库（dbGaP）中找到（研究登录号：phs000674.v1.p1）。从2008年7月开始，给完成同意书的研究对象邮寄唾液收集试剂盒（Oragene），GERA队列最后的样本于2011年2月获得。
实验方法 在KPNC RPGEH的生物储存库中提取DNA，并将样本置于96孔板中运送到UCSF的布莱克本实验室进行端粒长度分析。作为对照，所有平板的C04位置都是空的。通过Picogreen方法定量DNA样本浓度，标准化为35 ng/μl。将所有DNA样品热密封，并在抵达时将原始板储存在-80度冰箱中。测定当天，DNA样本在4度解冻然后转移至384孔板中。
分析原理 如图1所示，端粒长度是依照定量PCR获得的端粒产物/单拷贝基因产物（T/S）的比率来测定的(Cawthon 2002)。该方法的基本原理是：在一个给定样品中，使用特异于端粒DNA的引物进行PCR，更长的端粒将产生更多的PCR反应产物。这可以通过使用一组连续稀释的标准DNA以及这条标准曲线的定量PCR方法来量化。为了标准化输入DNA的量，一个单拷贝基因被平行扩增。端粒产物和单拷贝基因产物的比率反应了平均端粒长度。
 图1使用定量PCR测量端粒长度（TL）。对于每个样品，使用标准曲线法在单独的反应中测量T和S值。每个样本的T/S比率是由T值和S值计算来的。
硬件设计 由于这个项目得到了两年的资助，我们开发了一种能在6个月内分析大量样本的方法，这是至关重要的。因此，为了用一种可靠的高通量的方法分析110266个GERA样本，我们设计了一个集成的机器人系统，它由以下部件组成： 一个有96通道移液头的Biomek FXP液压处理器和一个Span-8模块 Thermo VAL 50英寸机器人手臂 三个Thermo Multidrop Combi试剂分配器 温控试剂存储器 两个Thermo ALPS 3000微孔板封口机 BioRad PTC-100 热循环仪 存储板和废物场（tips）之间的传送带 Thermo Cytomat 2 C4 自动培养箱 4台Roche LightCycler 480实时PCR仪 Agilent Vspin自动离心机 Thermo Tower of Power de-lidder和二维条码阅读器
该系统由Thermo CRS集成，并由Thermo Momentum调度软件控制。这个计算机系统可以通过虚拟网络计算（VNC）或远程桌面协议（RDP）进行访问，Microsoft LifeCam 视频摄像头可以通过iPhone或iPad的iCam应用程序实现视频监控。这些系统结合了远程控制和监测，允许7天24小时运行，总的每日处理通量为1920个病人样本（比手工分析完成的通量增加了10-20倍）。
试剂 引物：分析采用了由Cawthon（2002）提供，并经过Lin等（2010）改进的引物。端粒PCR（T运行）的引物是：telb[5’-CGGTTT(GTTTGG)5GTT-3’]，使用时的终浓度为100nM，tel2b[5’-GGCTTG(CCTTAC)5CCT-3’]，使用时的终浓度为900nM。单拷贝基因（人类β-珠蛋白）的PCR（S运行）引物是hbg1[5’-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3’]，使用时的最终浓度为300nM，hbg2[5’-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3’]，使用时的终浓度为700nM。这个引物只允许结合在端粒重复序列内，但应该注意的是它们被设计成在每个端粒重复序列内有一个碱基的错配（例如，从野生型端粒序列的TTAGGG变为TTTGGG）。这个设计允许结合和扩增靶标端粒序列，同时排除引物二聚体的形成。所有的引物都是采购自IDT (www.)，引物是使用标准脱盐方式制得的。
标准参考DNA和对照组DNA：我们的每个测定板中包括来自不同癌细胞系的8个对照DNA样本。C1，海拉细胞；C2，人胚肾细胞（293T）；C3，人肺癌细胞（H1299）；C4，感染hTER-PD7的人膀胱癌细胞；C5，感染hTER-PD11的人膀胱癌细胞；C6，感染hTER-PD15的人膀胱癌细胞；C7，感染hTER-PD19的人膀胱癌细胞；C8，人膀胱癌细胞（UMUC3）。
用DI缓冲液对每个对照DNA以三倍梯度稀释3次，结果得到每个对照组DNA的四个稀释点。PCR反应中的最高浓度为16 ng/μl。这些对照DNA样本允许我们创建8条标准曲线，然后将它们整合成一条复合标准曲线，用于计算T和S的浓度。整个项目中稀释的对照DNA样本是单批制备的，等分并保存在-80度中。
拥有8个对照DNA样本，每个样本具有四个浓度，允许计算出一条复合的标准曲线，其不完全依赖于一条标准曲线的精确度；因此这种方法比基于单一标准曲线的方法更加强大。需要权衡的是每个标准曲线测定6个点会导致使用太多的孔。为了解决这个问题，为输入DNA选择标准化为35ng/μl的浓度。因此，输入DNA的浓度范围是非常狭窄的，需要落在三倍稀释的四个浓度点的范围内。
大肠杆菌DNA：测定中加入大肠杆菌DNA以减少孔与孔之间的检测误差；因为T引物和S引物都不能在大肠杆菌DNA中扩增。将大肠杆菌储液（600 ng/μl）:冻干的大肠杆菌DNA（Sigma-Aldrich，目录号：D2001）重悬于无菌Millipore水中至600 ng/μl。将重悬的DNA在室温下旋转2小时然后储存在-20度直至进一步使用。变性缓冲液 (25 mM Tris-HCl, pH 8.4; 62.5 mM KCl, 3.8 ng/μl of E. coli DNA) 是通过使用Platinum Tag 试剂盒(Invitrogen, cat no. 10966-083) 中提供的10×PCR缓冲液 (200 mM Tris-HCl, pH 8.4; 500 mM KCl)和600ng /μl大肠杆菌DNA储备液制成的。整个研究中的变性缓冲液是单批制备的，并以每批60个板作为单独等份储存在-80度中。
U、T和S混合物：U混合物包含Tris-HCl，PH 8.4；KCl，MgCl2，dNTPs和DMSO。U混合物由10×PCR缓冲液和50mM MgCl2(来自Platinum Taq试剂盒)，100mM dNTP（Roche Applied Science，目录号03622614001）以及DMSO(Sigma-Aldrich，目录号154938)制成。T混合物由tel1b和tel2b引物组成。S混合物由hbg1和hbg2引物以及MgCl2组成。U、T和S混合物在整个研究中是同批制备的，并依照单独的等份储存在-80度中。 SYBR Green I：SYBR Green I (10×)工作存储液是由DMSO（Invitrogen，目录号S7585）中的10000×原液用ddH20制备成的，并单独等份分装包裹在铝箔中储存于-80度。
Platinum Taq聚合酶：Platinum Taq聚合酶采购自Invitrogen并保存在-20度中。整个研究采用了同一批次的大量的Platinum Taq聚合酶。最终的反应混合物包含：20 mM Tris-HCl，pH 8.4；50 mM KCl；每种dNTP 200 μM；1%的DMSO；0.5×SRBR Green I；每个反应中包含16.5ng的大肠杆菌DNA；每11 μl反应物包含0.44单位Platinum Taq DNA聚合酶。
测定板设计 将来自每个样品板的96个DNA样品放置在384孔板的一个象限的96个孔中。四个象限中的三个包含来自三个不同原始样品板中的样品。第四象限包含如下所述的对照样品。以这种方式，三个样品板就与对照组一起被分析了（图2）。一个计算机生成的随机板测试方案被开发出来，因此任何特定的源DNA板都不会与其他源DNA板进行一次以上的测试。8个对照DNA样品中的每一个都进行以三倍为梯度的连续3次稀释；分别独立的完成3次连续稀释。将所得的96个对照样品（8个对照×4个稀释度×3个重复稀释液）置于第四象限中。把来自3个原始样本板的样品和96个对照样品一起排列的384孔板称为超级板。将每个DNA样品置于用于T测定的一对相同的超级板中，并且类似地将同样的DNA样品放置在用于S测定的一对相同的超级板中。同样的DNA也被放置在另外两对T超级板中，具有不同于源板的配置，以及另外两对S超级板中。因此，每个样品在六个T板和六个S板中进行测定。  图2检测板设计。由S1，S2和S3指示的位置表示来自板1,2和3的测试样本，具有C的位置表示对照组。
实验步骤 使用Thermo Multidrop Combi将30μl变性缓冲液分配到384孔板（Biorad目录号HSP-3901）中，并使用Biomek 96通道加样头将1.5μl DNA样品与变性缓冲液混合。同样的，将1.5μl对照DNA稀释标准物移液到相同的384孔板中。384孔板的编排方式如图2所示。这个384孔板在热循环仪(Biorad PTC-100)中95°加热10分钟。
将U混合物，SYBR Green，Taq聚合酶，和T混合物(用于T运行)或者S混合物(用于S运行)制备成完整的主混合物。使用Thermo Multidrop Combi试剂分配器将7.5μl测试用量的主混合物加入到384孔PCR板（Roche Applied Science，目录号0510243001）的每个孔中，并在Biomek平台上使用96通道移液头将3.5μl变性的DNA样品混合到每个孔中。通过Thermo ALPS 3000用一个光学透明的盖子（Thermo目录号AB3799）将PCR板热密封，使用Agilent Vspin离心机将试剂简单旋转离心下来，然后装载到LightCycler 480上进行qPCR。
T运行的热循环曲线如下：96°变性1分钟1个循环，96°变性1秒，退火/延伸54°60秒，同时伴随着荧光数据收集，运行30个循环；对于S运行：96°变性1分钟1个循环，95°变性15秒，58°退火1秒，72°延伸20秒，在83°保持5秒进行数据收集，运行35个循环。
数据分析 从原始测定数据中分析相对端粒长度时，总体目标是在整个队列中获得一致的高质量的端粒长度，同时最小化整个实验期间的批次效应和实验非平衡性。这个目标是通过创建扩展的标准曲线进行分析从而控制非生物来源的噪音来实现的。
第一步是过滤掉差的对照组。这是通过创建每个超级板上的每个对照组样品的线性拟合标准曲线来实现的。计算所有对照组稀释系列的衍生标准曲线斜率的中位数，并用于检测表现不佳的对照组；如果abs（斜率-中位数）> 0.2，则标记该对照组。试图通过移除最偏远的数据点并重新计算斜率来恢复被标记的对照组。如果斜率仍然偏离中位数大于阈值量，则在进一步的分析中将这个对照组移除。
对于每个样本，通过使用超级板上与对照组物理上最接近的样本孔来获得（样品）标准曲线的评估值。由于每个样本都经历了两次端粒测量（T）和两次单拷贝基因测量（S），所以通过将两次T测量中的每一次与两次S测量中的每一次进行对比从而创建四种测量。为了获得更多的高斯分布，我们构建了T/S比率并对其进行对数转换（以2为底取对数）从而创建运算量log2（T/S）（表示为LTS）。
每个样品至少在不同的板中运行3次。因此，一个样本通常有12次测量，但实际数量变化从4次到20次不等，由于偶然的PCR反应失败而减少。然后将测量结果的LTS拟合到混合效应模型中，以控制非生物误差源，例如整体超级板变化和整体超级孔变化。
这个模型的残差成为每个样本的最终LTS测量合集。样本的相对端粒长度被计算为LTS残差的中位数。
结果 对照样本属性 计算所有超级板上所有稀释度的对照样品的标准曲线，并过滤掉那些不符合QC阈值（对照组为2.4%）的样品。图3A展示了8组对照样本的平均标准曲线的斜率和截距。对照样本集良好聚类，但ANOVA检测显示对照样本中斜率(P＜2e-16)和截距(P＜2e-16)有显著差异。
图3B展示了用4种Light-Cycler qPCR系统测定的分组的对照组样品的平均标准曲线的斜率和截距。ANOVA检测显示qPCR系统在斜率(P＜2e-16)和截距(P＜2e-16)方面有显著差异。
斜率与对照样品的线性回归产生一个经调整的R2相关性系数0.013。斜率与qPCR系统的线性回归产生一个经调整的R2相关性系数0.658。这两个因素共同解释了三分之二的斜率变化。通过匹配不同系统上的对照组并将LTS值归一化为单个有效系统来控制qPCR的系统异质性。在混合效应模型中通过超级板孔因子控制对照组样本的不均一性。  图3（a）八组对照样本的平均标准曲线的斜率和截距。误差线表示±1标准误差。（b）四种Light-Cycler qPCR系统上对照样品的平均标准曲线的斜率和截距。 总体样本成功率 最初测定了总共106902个人的端粒长度。我们注意到，使用机器人系统，实验室处理是在4个月时间框架内完成的。如果没有自动化，这个项目所需的这种快速吞吐量将是完全不可实现的。
图4提供了每个个体重复测量的次数分布。87%的绝大多数个体有12次或者更多的重复测量。一个相对较小的比例，12%的个体有8至12个重复，然而有11个受试者有少于4次重复，1.2%的个体拥有少于8次重复然后被过滤掉了。
 图4每个样品端粒长度测量次数的累积分布
我们也关注个体内不同重复之间的差异，当出现一个高水平的变异时，表明存在错误的测量。图5显示了受试者内的标准偏差和来自样本中位数的稳健的中位数绝对偏差的累积分布。图6A显示了相对于样本中位数进行绘图的中值绝对偏差。如在两幅图中看到的那样，受试者内变异性是偏斜的，其中一部分个体具有较大的样本内重复性变异。图6B表示受试者内CV与非对数校正的平均端粒长度（T/S）的关系。由于这些样本可能包括不可靠的测量，在这些数据的指导下，我们进一步删除了绝对中位偏差在阈值＞0.4的个体。这导致了另外1372个受试者被排除（占总数的1.3%）。因此，随后分析的最终样本包括总计105539个具有端粒测量总结的受试者。
 图5个体内端粒长度测量偏差的累积分布  图6（a）表示个体内log2(T/S)的中位数绝对偏差（MAD）与端粒长度的中位数的转换（MAD值被2截断）。（b）个体内变异系数与非对数校正的端粒长度（T/S）。 来自我们实验室的血液来源的白细胞DNA样本的CV值是3-4%；对于这个队列中唾液来源的DNA，所有样本的CV中位数是5.1%，CV平均数是5.6%±3.1%。表1给出了样本CV的中位数与样本重复测量次数。样品CV不随重复次数的改变而显著改变；尽管如此，样品重复次数少于8次被认为是欠采样并被删除。
 端粒长度与年龄和性别之间的关系 我们接下来分别对男性和女性检查了端粒长度与年龄的关系（图7）。这种关系的几个特征值得注意，特别是性别二态性。然而，总体而言，男性比女性具有更短的端粒长度，其区别在于年龄依懒性不同。对于男性来说，从成年早期到成年晚期（大约75岁）呈连续线性下降，此时下降结束，最终在80岁左右略有上升（对70-78岁男性与80-90岁男性进行t检验，P=0.0210）。相比之下，在女性中，从青春期到中年期，有一个同样的线性端粒长度下降，然而这种模式在50岁左右发生改变，此时衰退减少并最终也在75岁左右发生逆转（对70-78岁女性与80-90岁女性进行t检测，P=0.000796）。在40岁之前，端粒长度在女性中似乎略微但不是明显的较短（对年龄小于40岁的男性和女性进行t检验）；然而在50岁以后，相反的情况发生了，端粒长度有利于女性的差异逐渐增大（对年龄大于50岁的男性和女性进行t检验，P＜2.2e-16）。
 图7在男性和女性中端粒长度中位数与年龄的函数关系
端粒长度变化和年龄之间的关系 最后，我们还研究了端粒长度随着年龄因素的变化。我们以十年为尺度计算了每个性别端粒长度的变化（图8A）。通过十年间的变化关系图可以看出，在男女两性的35岁时端粒长度的变化开始出现一个明显的线性增长模式。分别为每个性别的这些数据拟合一个线性回归模型，用各年龄段的测量方差作为因变量，年龄作为自变量。对于男性，斜率的回归系数是0.00102 ± 0.00010（零斜率的t检测；P＜10-12）；同样的，对于女性，斜率的回归系数是0.000920 ± 0.000098（零斜率的t检测；P＜10-12）。
为了比较，我们检查了个体内的端粒长度测量值的变化量，由中位数绝对偏差确定。如果我们将个体（MAD）值按十年分组并且绘制平均MAD曲线（图8B），显然个体内端粒长度的变化不随年龄而增加。
 图8.（a）测量到的个体间端粒长度随年龄改变的变化量。(b)测量到的个体内端粒长度随年龄改变的变化量。
这些结果表明，PCR反应参数的系统性差异可能表现为不同质量的样品或DNA制剂与年龄的关系，不能解释观察到的端粒长度变化量的增加与年龄的关系。
讨论 我们已经提交了迄今为止单个人群样本中创建端粒长度数据库的最大的研究。在短时间内开发出这些数据需要研发一套用于测定的新型自动化系统。传统上通过手工完成的许多步骤，现在都通过机器人系统来完成从而实现高通量。在此方法中还值得注意的是，运行过程中保证质量的程序，包括重复性检测，样品放置的随机性，以及对实验进行实时评估以检测浮现的问题。
将我们的关于性别和年龄与端粒长度的关系的研究结果与之前的研究进行比较是有意义的，之前的大部分研究使用血液白细胞和其他类型的细胞作为端粒DNA的来源。在这个研究中，我们观察到一个随着年龄增长总体下降的模式，但这个下降模式具有性别差异，和在其他研究中已经观察到的一样。在我们的数据中，随着年龄的下降趋势在男性和女性中呈高度二态性，50岁以后男性持续下降，但是女性不是。这些结果与许多其他研究结果是一致的，那些研究已经证明，与女性相比，男性端粒长度随着年龄增长更强烈的下降（Iwama et al. 1998; Unryn et al. 2005; Vasa-Nicotera et al. 2005; De Meyer et al. 2007; Nordfjall et al. 2010），但与其他人研究结果不一致（Gardner et al. 2014）。这些结果也与白细胞端粒长度的五年随访研究结果是一致的，中年男性比女性端粒缩短更快（Farzaneh-Far et al. 2010）。
在男女两性中，我们看到端粒长度在晚年时轻微逆转，约从75岁开始。在一项较小的研究中，年龄与端粒长度变化之间的关系也表现出这个结果，在一个哥斯达黎加普通人群中，在年龄约80-100岁之间，白细胞端粒长度的减少量比早年间年龄相关的减少量要少（Rehkopf et al. 2013）。
我们在大型GERA队列中报道的端粒长度与年龄之间的非单调关系，也许可以解释之前的报道关于端粒长度与年龄之间的不一致性。端粒长度的逆转发生在死亡率增加的时候，因此，这可能反映出了端粒长度较长者的生存优势。这一推测随后可以被这个队列变老时端粒长度和死亡率之间的关系直接证实。
我们发现随着年龄的增长，TL的方差增加也很有趣，而且在我们以前的知识中是没有报道过的。我们排除了方法学或技术原因，这些可能被用来解释随着年龄增长的方差增加。这表明影响端粒长度的环境因素可能随着年龄增加而更加显著。或者，这可能代表了一种选择偏见，因为参与提供唾液样本的老年个体比同年龄的典型个体“更健康”。进一步探讨这个问题的一种方法是通过检查亲属之间端粒长度的相关性，按亲属的年龄分层。由于GERA队列的巨大数量以及血缘关系个体的存在，我们将能够在未来的出版物中报道这些分析结果。
GERA队列包含一个丰富的纵向电子健康数据，以及来自于自我调查报告和环境暴露物获得的人口统计学和行为学数据，自我调查报告和环境暴露物获得来自于受试者居住环境数据库的地理编码链。另外，该队列具有可得到的完整的全基因组基因型数据。将这些其它来源的信息与这里描述的端粒长度数据结合起来，将有助于大规模的阵列分析，从而解决有关决定端粒长度的遗传和环境因素的问题，以及在衰老过程中端粒维持的作用，各种疾病的发病和死亡率等重要问题。
结论 我们已经完成了迄今为止最大的单个人群的相对端粒长度测量。对于这个基于唾液的队列，样本的平均变异系数是5.1%，而在同一实验室中其他样本组的血液来源的白细胞测定中为3-4%。总体而言，发现随着年龄的增加，男性和女性的端粒长度均减少。在50至75岁之间，男性的端粒长度比女性减少的更多，但是在80-90岁的男性和女性群体中，端粒长度都略有增加。个体间端粒长度的变化随年龄增加而增大，但个体内端粒长度的变化不是这样的。 致谢 我们感谢 Judith Millar在准备发表手稿方面的帮助。我们感谢北加利福尼亚Kaiser Permanente的成员们慷慨的同意参与Kaiser Permanente地区的关于基因、环境和健康的研究计划。这项工作得到了美国国立卫生研究院资助的RC2 AG036607的支持。关于RPGEH参与者的登记和调查以及样本收集工作，得到了Robert Wood Johnson基金会、Ellison医疗基金会、Valley基金会以及Kaiser Permanente政府的资金支持。有关数据访问的信息可以从以下网址获得：http://www.ncbi.nlm./projects/gap/cgi-bin/study.cgi?study_id=phs000674.v1.p1和https://rpgehportal.kaiser.org.
添加在试验中的注释：参考Kvale et al.2015 (pp.1051–1060)和Banda et al.2015 (pp.1285–1295)在这个问题上的相关工作。
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