实验 | 染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验操作指南

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真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前最常用研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

实验准备

实验材料：细胞样品

试剂、试剂盒：甲醛、甘氨酸、PBS、SDS Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒

仪器、耗材：离心管、超声仪、电泳仪、离心机

ChIP的一般流程

甲醛处理细胞 → 收集细胞，超声破碎 → 加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合 → 加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀 → 对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合 → 洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物 → 解交联，纯化富集的DNA-片断 → PCR分析。

请ChIp具体操作流程：第一天

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 μl 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200μl含2×106个细胞。这样每100μl溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400μl SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800μl。

7、超声破碎：VCX750，25%功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。

（二）、除杂及抗体哺育

8、超声破碎结束后，10，000g 4ºC离心10min。去除不溶物质。留取300μl做实验，其余保存于-80ºC。其中，100μl加抗体做为实验组；100μl不加抗体做为对照组；100μl加入4μl5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65ºC处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9、在100μl的超声破碎产物中，加入900μl ChIP Dilution Buffer和20μl的50×PIC。再各加入60μl ProteinA Agarose/Salmon SpermDNA。4ºC颠转混匀1h。

10、1h后，在4ºC静置10min沉淀，700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20μl做为input。一管中加入1μl抗体，另一管中则不加抗体。4ºC颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果

取100μl超声破碎后产物，加入4μl5MNaCl，65ºC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

请ChIp具体操作流程：第二天

（一）、免疫复合物的沉淀及清洗

12、孵育过夜后，每管中加入60μl ProteinA Agarose/Salmon SpermDNA。4ºC颠转2h。

13、4ºC静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4ºC颠转10min，4ºC静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。 洗涤溶液： low salt wash buffer-one wash → high salt wash buffer-one wash → LiCl wash buffer-one wash → TE buffer-two wash。

15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100μl10%SDS，100μl1MNaHCO3，800μl ddH2O，共1ml。每管加入250μl洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500μl。

16、解交联：每管中加入20μl 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65ºC解交联过夜。

请ChIp具体操作流程：第三天

（一）、DNA样品的回收

17、解交联结束后，每管加入1μlRNaseA（MBI），37ºC孵育1h。

18、每管加入10μl 0.5MEDTA，20μl 1MTris.HCl（PH6.5），2μl 10mg/ml蛋白酶K。45ºC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100μl ddH2O。

（二）、PCR分析

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

注意事项

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。