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小鼠淋巴结只有一点点，又要提RNA跑PCR又要做WB又要做病理切片，我怎么办？挺急的在线等…. 原代细胞量特别少，又要提RNA跑PCR，测DNA我怎么办？挺急的在线等…. 在线等不来…. 于是我找了官网的Trizol说明书，说明书告诉我可以用Trizol把RNA\DNA\蛋白都提取出来 我信了它的邪。 Trizol中有酚和异硫氰酸胍，和β-巯基乙醇。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。氯仿：虽然有变性蛋白的作用，但主要用来分相。所以理论上来说Trizol是可以用于提取蛋白质的。
经过实践，得到下图，图片中那一丢丢小沉淀就是我们要的蛋白（图1）。 图1 一、方法学（官网有说明书） 1. 以1mL Trizol提取RNA为例，将水相完全吸掉后，加入300 μL无水乙醇，颠倒混匀涡旋混匀30s，使中间层快状物体完全溶解，置冰上室温5 min，离心4℃ 4000 rpm（2000g） 5min（图2） 图2 2. 取出上清（0.5 mL）置新EP管中，加入3倍体积1.5 mL异丙醇（也有方法学写丙酮、甲醇、氯仿），颠倒混匀30s，置冰上10 min，离心4℃ 12000 rpm 10 min 。（将有机溶液例如丙酮和乙醇加入蛋白质溶液时，和高浓度盐类似产生沉淀，这是因为它们能够降低蛋白质的溶解度。在温度为10 ℃左右时蛋白质在有机溶剂中容易变性，所以在沉淀时必须特别注意温度0 ℃-4 ℃）离心后就能看见图1的沉淀，我是把上清分成两管加3倍体积有机溶剂沉淀蛋白质的，因为如果蛋白过多，后期可能不易于溶解。 3. 弃上清，加入1ml 0.3M盐酸胍含2.5%甘油的95%乙醇（首先，甘油可以降低体系的极性，体系的极性降低了，有助于蛋白结构稳定；第二，甘油可以降低体系的凝固点，这样利于蛋白在低温下保存，如果不加甘油的话，蛋白反复冻融数次就会失活，甚至变性），将沉淀用枪吹散，室温放置20分钟，4℃ 12000 rpm 5 min，弃上清，重复两次。加入甘油的试剂尽量1个月用完。 4. 重复步骤3。 5. 加入无水乙醇洗涤沉淀，静置10-20 min后4℃ 12000 rpm 5 min，弃上清。 6. 室温放置10 min, 使乙醇挥发掉，不要采用真空抽干，避免过度挥干，降低蛋白的溶解度，加入200-300 μL 1%SDS置50℃温浴使蛋白完全溶解。浓度大约是1-2 mg。如果较难溶解，可以水浴30分钟就放在超声清洗机里10 min。最后完全不溶解的蛋白可以短暂离心去除。（网上还有网友推荐使用8MUrea+2MThiourea+4%CHAPS溶解沉淀所得蛋白质。大家可以尝试。） 7. 准备上样即可
官方说明书链接：https://www./document-connect/document-connect.html?url=https://as//://assets./TFS-Assets/LSG/manuals/trizol_reagent.pdf 二、常见问题 1. 得率低：样品裂解或匀浆处理不彻底。一定要充分裂解样品，注意加入Trizol后静置的时间。 2. 最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解：蛋白过度变性不易于溶解或蛋白量大。不宜采用强有机溶剂变性，量大可分装后加入有机溶剂。 3. 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分，有有机溶剂残留，可增加步骤5静置时间。 三、注意事项 1.以上各试剂的用量都是以1mLTrizol为准，Trizol体积变化，各试剂用量随之等比例变化。 2.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。 |
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