【原】Trizol法提取视网膜组织RNA的步骤及注意事项

1）液氮速冻：新鲜组织块快速放入液氮中速冻。注：RNA与组织状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。

2）组织研磨：将组织直接放入研钵中，加如液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，直至研磨完全。注：切记要在液氮中研磨，也是起来防止RNA降解；研磨一定要充分，使组织快变小。

3）匀浆：组织样品按50-100mg/ml Trizol加入Trizo1，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。注：组织体积不要超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好；加入Trizol后要充分吹打开，目的时使组织中的核蛋白体、多糖等与RNA分离。

4）将Trizo1补足到1mL，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-80℃长期保持。

5）12000rpm离心5min，弃沉淀。

6）按200u1氯仿/ml Trizo1加入氯仿，振荡混匀后室温放置2min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

7）4℃，12000rpm离心15min。

8）小心吸取上层至新的离心管中。注：可以大枪头＋小枪头，防止吸到上清以外的组织。

9）按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，-80℃过夜沉淀RNA。注：缓慢颠倒混匀，防止RNA断裂。

10）4℃，12000rpm离心30min， RNA沉于管底。注：离心前不要剧烈震荡，也不需要上下颠倒混匀。

11）小心弃上清，按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入预冷的75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。注：不要剧烈震荡，防止RNA断裂。

12）4℃，8000g离心5min，尽量弃上清。

13）室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

14）可用20ul ddH₂O溶解RNA样品。注：H₂O须用DEPC处理并高压或加入RNA inhibitor。

15）测OD值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA OD260/OD280值在1.6-1.8之间。

16）可放-80℃冰箱长期保存。

注：

（1）以上所用所有仪器需要经过DEPC处理；

（2）全程实验需要佩戴口罩，手套；

（3）所有的枪头、EP管需要用无RNase酶耗材。