免疫系统复杂性使其研究至今未能完全整体研究，限制的主要原因之一就是以往测序技术是基于组织块平均表达水平。本文简要介绍单细胞测序技术的发展和优势后，对其在免疫系统内各个组成部分的应用进行综述，细致具体说明单细胞测序技术在面对解决免疫系统高度复杂问题上的不可或缺性。
免疫细胞的复杂网络相互作用和反应，产生由多种细胞类型组成的多种细胞生态系统。在这个生态系统中，先天性和适应性免疫细胞在功能需求变化和各种入侵的情况下维持和保护组织功能，完整性和体内平衡。表征这种固有的复杂性需要在单细胞精确度情况下进行研究。最近的进展，如大规模平行单细胞RNA-Seq和复杂的计算方法，正在推动大家对免疫学理解的一场革命。在这里，研究人员概述了单细胞基因组学方法目前形势，以及展望使用单细胞技术破译免疫的适应性和先天性成分。
免疫涉及先天性和适应性免疫细胞，与其他细胞相互作用，在组织中形成动态细胞群。免疫学家对免疫系统细胞进行了广泛的分类，将其功能特征、细胞命运和谱系关系与分子标记结合起来。这一成就是通过显微镜和流式细胞仪，乃至功能测定、动物模型以及最近的基因组学等工具实现的。然而，免疫细胞普查仍然不完整。单细胞基因组学技术的最新进展开始允许我们填补这些空白，一次只检查免疫系统的一个细胞。
用于表征免疫系统细胞的技术
多年来，三种主要技术已经建立并用来分类免疫细胞。最突出的是通过流式细胞术进行免疫表型分析，分类后的特定活细胞亚群可用于下游实验。另外两类包括各类杂交技术（原位杂交，ISH；单分子RNA荧光原位杂交，smRNA-FISH；免疫组织化学IHC）和显微镜方法，它们提供了细胞各方面信息来表征免疫细胞。
虽然这些方法中的每一种都提供了宝贵的信息，但却往往顾此失彼。单细胞方法仅限于探测一些选定的RNA或蛋白质。相反，基因组分析则依赖于分析异质混合物的平均值，这会掩盖了样本中细胞的多样性，或者依赖于分析分类后的细胞亚群，这又回到了单细胞方法的不足。
单细胞基因组学和空间分析方法的最新进展
在过去几年中，单细胞基因组学的革命性进展使其能够对数千个单个细胞中的分子进行无偏差的全基因组定量，以及对原位蛋白质和RNA的多重空间分析。
在单细胞分析方法中，最成熟和广泛传播的方法是单细胞RNA测序（scRNA-seq），其旨在全方位测量细胞中基因表达水平。尽管单个细胞中测序物质较少，但是scRNA-seq可以达到既灵敏又准确，可以使用统计方法量化单个细胞之间基因表达的细微变化。
免疫系统单细胞分析
单细胞基因组学研究可以提供免疫系统的许多关键方面信息（图1）。研究已经用单细胞基因组学技术探索了脊椎动物免疫系统的先天和适应性方向，提供了重要的见解。
图1 免疫单细胞基因组
免疫系统非常适合以单细胞分辨率进行研究。 免疫应答涉及多种细胞类型，可进一步细分为更细粒度的亚型和不同的细胞状态，可在整个反应期间进行。此外，单细胞分析提供了对细胞间网络的见解，并允许我们比较个体和物种的免疫反应。
先天免疫
先天免疫反应代表了对病原体快速防御的第一道屏障。这些内在的细胞自主反应在各种病原体相关分子刺激时进行。可使用单细胞方法来研究这些反应的随机性，例如在树突细胞上。
树突状细胞，免疫系统中的第一反应者
树突细胞（DC）是免疫系统的哨兵，存在于血液，淋巴器官和许多组织中。这些细胞吞噬抗原，然后迁移到淋巴结，将抗原呈递给T细胞。免疫细胞中的早期scRNA-seq实验仅在18个骨髓来源的小鼠树突细胞（BMDCs）上用脂多糖（LPS）刺激4小时后进行。特别一点是，在刺激后4小时，数百个关键免疫基因在细胞中双峰表达：虽然一些细胞以非常高的水平表达，但在其他细胞中几乎没有表达。后续研究通过scRNA-seq使用三种病原体相关分子模式（PAMP）同时记录时序过程分析了1,700个小鼠BMD。抗病毒基因的“核心”模块很早就被一些“早熟”细胞表达，响应LPS刺激，但后来在所有细胞中被激活。分析单个细胞显示，该反应通过干扰素介导的旁分泌信号从早熟细胞通过细胞-细胞间相互作用，与其他免疫细胞协调。
另一方面的研究上，使用人类DC的scRNA-seq研究揭示了先前未报道的DC亚群。通过分析来自类风湿性关节炎患者的人扁桃体和滑液，显示来自一个新的DC亚群的细胞与T细胞直接接近，支持它们在产生免疫应答和自身免疫中的作用。
先天性淋巴细胞（ILCs）及其发展
先天性淋巴细胞（ILC）存在于粘膜屏障中，对宿主防御和组织稳态非常重要。由ILC执行的完整免疫任务范围仍然未知。
单细胞RNA-seq可以解释ILCs发育途径的轨迹细节和调节（图2A，B）。对小鼠骨髓祖细胞的分析揭示了前体亚群，并描绘了不同的ILC发育阶段和途径。该研究突出了标志物，例如祖细胞上的PD1受体和流感感染和肺部炎症后刺激的细胞，以及转录因子Bcl11b的调节。由于PD1受体的配体靶向肿瘤免疫疗法，这些发现可能对疾病和治疗有影响。
图2 单细胞数据推断细胞轨迹
（A）在分化过程中，单个细胞可以沿着“假结合”排列，这表示它们在分化途径中的进展。以这种方式描述的过程可以是线性的，或者可以涉及到多个最终命运的分支。 （B）根据细胞轨迹分析的生物过程的实例包括干细胞向终末分化命运的进展，未致敏免疫细胞对感染的反应，以及循环免疫细胞对它们最终所在组织的适应性。（C）从小鼠疟疾感染模型产生的scRNAseq数据推断的分叉假时间轨迹。每个点代表使用贝叶斯高斯过程潜变量模型降低维数的单个单元。然后以伪时间对这些细胞进行排序，并使用高斯过程的重叠混合物推断出两个同时和分叉的发育轨迹（红线和蓝线）。每个点的颜色表示单元格属于红色或蓝色趋势的概率。
细胞 - 巨噬细胞谱系及其在健康和疾病中的动态
巨噬细胞是一个广泛的吞噬细胞家族，不仅在与病原体相遇中发挥作用，而且在组织稳态中也有不同的作用（例如，脑中的小胶质细胞，骨中的破骨细胞）。单细胞分析揭示了两种类型的角色以及组织适应。
谱绘感染荧光标记的肠炎沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌的小鼠巨噬细胞显示出与细菌存活和增殖相关的多种巨噬细胞状态，并将病原体状态与宿主信号传导途径联系起来。一种侧重于病原体增殖和巨噬细胞反应的类似方法，在感染活跃增殖细菌的巨噬细胞中鉴定出M2样状态。
先天免疫细胞和细胞内在反应的比较研究
免疫学的挑战之一是了解免疫系统相对于人类如何在不同的动物模型中进化。由于基于块状组织谱绘的组成和胞内变化都会影响这种比较，而由细胞表面标志物定义的亚群可能难以匹配，并且非模型生物体中可能缺乏抗体和标记物，以上这些都加剧了比较难度。
scRNA-seq有助于规避这些挑战。例如，T细胞、NK细胞和骨髓样细胞转录组在斑马鱼（脊椎动物模型生物体）中进行了表征。在另一个实例中，scRNA-seq描述了用dsRNA刺激的四种哺乳动物物种的成纤维细胞的细胞内在先天免疫应答。这样就突出了跨物种，个体细胞和蛋白质序列差异的不同基因表达之间的关系。
适应性免疫
新型淋巴细胞亚群
免疫学家已经了解淋巴细胞亚群的多样性及其在免疫中的作用，利用这些进展，scRNA-seq正在进一步发现新的淋巴细胞亚群和状态、它们的分子基础以及它们与生理和疾病的关系。
例如，CD4+ T细胞区室的可塑性和复杂性特别适合通过scRNA-seq方法进行研究。小鼠CD4+ T细胞群的scRNAseq分析使类固醇生成酶与细胞表面标志物相关，该细胞表面标志物用于富集该亚群以进行进一步的功能表征。
其他研究集中于免疫亚群内变异的表征。例如，scRNA-seq有助于表征Th17群体内的变异，其可以跨越与不同水平的“致病性”相关的连续谱，或者在过继转移时在动物模型中诱导自身免疫疾病的能力。
淋巴细胞分化
scRNA-seq对细胞状态的高分辨率映射可以详细推断发育过程。在大量转录组学方法中，时间序列用于研究发育和分化。相比之下，scRNAseq的单细胞分辨率允许从静态快照推断时间序列，并揭示跨时间点的细胞状态的连续体（图2A和B）。被称为“伪时间”，这个非观察维度测量了细胞经历转变的进展。
值得注意的是，当动态过程与细胞活化或分化同时发生时，例如在许多免疫过程中诱导细胞增殖时，这种特定的贡献就可以识别和研究，或者分离以突出其他现象。当细胞增殖与其他免疫反应相关时，后一种方法可能具有挑战性。
分化进程之上的是细胞命运决定。这些进程可以是单个分叉，例如CD4 + T细胞命运选择，或复杂的层次结构和其他关系，如造血。通过适当的计算分析，可以从快照（当差异是异步的和正在进行的）和时间过程数据中探索这些细胞命运决策。这些方法曾用于研究T细胞发育和T辅助细胞分化成Th1和Tfh命运（图2C）。
免疫谱库分析
适应性免疫应答需要非自身抗原和由T和B淋巴细胞表达的抗原特异性受体分子之间的相互作用。抗原受体（AgR）氨基酸序列存在巨大潜在多样性，免疫系统可以特异性地识别必需的大范围的抗原分子。AgR分子的广泛多样性使我们可以假设具有相同受体DNA序列的细胞来自相同的原始发育淋巴细胞。这单细胞技术是研究抗原受体库以及它们与细胞亚型和状态的关系的理想选择。此外，AgR是异二聚体蛋白质，其包含两个独立编码的蛋白质链，两者通常决定每种受体的抗原特异性。单细胞测量识别每个细胞中的成对受体链。
最近，已经在scRNA-seq的背景下研究了AgR序列，其可以同时报告细胞受体和表达谱。由scRNA-seq读数组装的TCR序列（图3A）用于证明在小鼠沙门氏菌感染期间，单个扩增的T细胞克隆型内的转录状态的广度。在另一个实例中，在对疟疾的免疫应答期间将TCR分析与伪时间和分支推断组合，以显示在Th1和Tfh命运中都可以发现克隆相关的同胞细胞（图3B）。
图3 抗原受体序列的单细胞分析揭示了转录状态之间的克隆分布
（A）沙门氏菌感染期间来自小鼠脾CD4+ T细胞的scRNAseq数据的独立成分分析。每个点代表一个单独的细胞。阴影区域表示与降维空间的每个区域相关联的可能的功能标识。紫色填充点表示克隆相关的细胞并共享一组特定的TCR序列。克隆相关细胞分布在整个基因表达空间中。 （B）疟疾感染期间在不同时间点用来自小鼠脾CD4+ T细胞的scRNAseq数据的细胞类型分配。每个点代表具有y轴位置的单个细胞，其指示它是Th1细胞而不是Tfh细胞的可能性（高值意味着Th1同一性，低值意味着Tfh同一性）。有色点表示由于共享的TCR序列而推断为克隆相关的细胞对。可以发现兄弟姐妹细胞，其中一个是Th1细胞，而另一个是Tfh （C）连接α的数据集和βTCR链，提供足够功力以允许机器学习推断来自识别相同抗原的不同T细胞的共同序列基序。
细胞生态系统：免疫中细胞-细胞相互作用的综合观点
免疫系统需要复杂的相互作用网络来执行其功能（图4）。需要对个体细胞，细胞类型，其空间组织和功能相互作用进行综合观察，以实现免疫功能的系统级视图。单细胞方法已经加速了我们对免疫力的综合理解，研究人员预计该领域将来会有很多工作。
图4 免疫系统内互作网络
免疫应答涉及多种规模的网络，范围从细胞内基因调控网络到细胞因子或趋化因子介导的长距离细胞间通信。 如果我们要充分了解免疫生物学，理解这些网络的系统方法将是至关重要的，并且将通过应用多种不同的单细胞分析方法加速。
现有的单细胞研究已经开始证明同时解决免疫应答的多个部分的能力。对来自黑色素瘤患者样本的4,645个个体细胞的分析揭示了肿瘤中存在的细胞生态系统的复杂性，以及可以在个体患者中进行比较的程度。虽然恶性细胞类型在患者之间表现出显著的多样性，但非恶性细胞（包括T细胞，B细胞，巨噬细胞，内皮细胞，癌症相关成纤维细胞（CAF）和NK细胞）各自按类型而不是肿瘤来源分组。此外，当单细胞谱与来自癌症基因组图谱（TCGA，http：//cancergenome.nih.gov/）收集的数百名患者的大量谱相结合时，它们揭示了不同细胞类型和可能调节的分子之间的依赖性。例如，肿瘤中高水平的CD8+ T细胞与其CAF的补体蛋白表达之间的相关性。
另一项研究在感染后第3天将未感染的小鼠与小鼠进行比较，分析了小鼠对疟疾的反应中的脾CD4+ T细胞、单核细胞和DC。对这些群体中趋化因子配体和受体表达变化的综合分析预测，单核细胞将支持活化的CD4+ T细胞向Th1命运的分化而不是替代的Tfh命运。这在T细胞活化期间和命运选择之前单核细胞耗尽的实验中得到证实。
两项研究均从scRNA-seq数据中的同源受体，共受体和/或配体的表达推断出细胞间通讯的过程。此外，很明显，在空间分辨的环境中分析单细胞基因表达的方法对于理解免疫系统细胞之间的相互作用非常重要。实际上，成像质谱流式细胞术已经确定了乳腺癌组织空间背景下免疫细胞的存在。
未来在免疫方面的应用
免疫系统由多种细胞类型组成，这些细胞类型协同工作以感知并适当地响应外来挑战和生理变化，以便监测和维持健康。如果免疫系统的精心协调的功能受到干扰，则可能出现诸如传染病，自身免疫疾病和癌症等疾病。
尽管已存在丰富的分类学和细胞命运知识，仍然没有完整的免疫细胞参考图可以使用。单细胞基因组方法作为新工具，有助于解决免疫学的一些基本问题——从细胞分类、组织结构、组织召集、发育生物学和细胞命运谱系，到生理学和体内平衡及其潜在的分子机制。
此外，为了深入了解免疫细胞的全部范围和功能，研究处于受挑战状态的免疫细胞是最有益的——也就是说，在疾病，感染，发育，衰老和环境变化期间表现出来。研究人体通常需要处理小样本；单细胞基因组方法在输入材料方面与这种限制高度兼容。
最后，遗传扰动（天然的或工程化的）也可以引起基因表达的变化，这些变化可能因对环境线索的响应或衰老等变化而有所不同。随着单细胞实验的成本下降，通过汇集的遗传筛选，以及通过廉价多路复用大量个体，使用它们的序列变异作为天然遗传条形码，可以在不同条件下分析更多的免疫细胞。
为了帮助迎接这一未来，免疫细胞图谱（ICA）正在努力成为国际人类细胞图谱计划（www.humancellatlas.org）的一部分。 ICA将评估不同分化阶段，不同组织和多种疾病背景下的免疫系统。为了正确地调查免疫细胞的范围，即使是最初的试点工作也将包括来自少数患有多种疾病的患者的样本。这种免疫系统表征需要临床医生，免疫学家，基因组学专家和计算生物学家之间的国际合作。
总体而言，这些类型的方法和项目将从根本上改变我们对感染，自身免疫，过敏，炎症性疾病和癌症的免疫功能和功能障碍的知识，并影响治疗发展。
以往在进行测序时采样以块状组织进行，导致测序结果是一个整块组织的平均行为，这在癌症研究中对结果影响更加严重，样本纯度往往难以提高，测序结果可信度也受会影响。免疫系统是这种测序方式的另一个重灾区，因免疫系统细胞行为的复杂性，平均化的研究方式往往不能足够研究这样高度复杂的系统。文中举例的经典案例有提到，树突状细胞在响应感染的细胞行为，只在单细胞测序结果才发现，最初响应仅存在几个“先驱”细胞中，随后才扩散至整个细胞群，这种研究发现在传统技术中是难以发现的。随着技术的发展，未来单细胞技术在研究具体免疫细胞行为，定能发挥其更大的作用。
参考文献：
[1] , et al. Single-cell transcriptomics to explore the immune system in health and disease. Science, 2017, Vol. 358, Issue 6359, pp. 58-63.
