整合多组学研究肝癌发展分子机制

文章通过基因组学、表观组学、转录组学和蛋白质组学分析的方法对肝癌进行全面综合分析，提高了我们对肝癌分子事件的理解，从而更好地了解可能改进治疗策略的分子靶点。

发表时间：2017.05

期刊名称：Cell

影响因子：30.41

机构：TCGA

一    研究背景

肝癌(Hepatocellular Carcinoma HCC)是全球第二大癌症死亡原因，全球每年大约有70万人死于肝癌。目前有多个已知的可能造成肝癌的危险因素，如：HBV或HCV感染、酗酒、肥胖等。这些危险因素导致肝损伤，并形成一个肝细胞坏死和再生循环往复的炎症环境，并使得染色体不稳定发展。在活性氧类、炎性细胞因子和纤维化增多的环境中，逐渐积累的遗传和表观遗传突变最终导致了肝癌的发生。

肝癌的发生和发展被认为是一个多步骤的过程，但肝癌形成的确切分子事件仍只被部分了解。

二     研究方法

样本选择： 样本来自Tissue Source Sites (TSS)提供的生物标本。

多种方法手段：

外显子测序（363位患者样本）——突变分析和拷贝数变异分析；

DNA甲基化芯片（191位患者样本）——甲基化水平分析；

转录组测序（193位患者样本）——基因表达分析和基因融合分析；

Small RNA测序（193位患者样本）——miRNA表达分析；

反相蛋白阵列分析（193位患者样本）——蛋白表达分析。

三      主要成果

1. 体细胞突变分析

图1     HCC体细胞突变景观与突变特征  

对363位HCC患者进行全外显子测序，平均每个样品测序覆盖度大于95%、测序深度大于20X，共鉴定到12136个基因有非同义突变。使用MutSigCV软件共鉴定出26个显著突变基因（SMGs）。26个SMGs中有18个已经在其它HCC研究中报道过，例如：TP53（31%）、AXIN（18%）、RB（14%）、CTNNB1（27%）、ARID1A（7%）、ARID（25%）、BAP(15%)、NFE2L(23%)、KEAP(15%)、ALB(13%)、APOB(10%)等。

未报道过的8个SMGs基因中，3%（10/363）的患者存在LZTR1突变，并且其中8位患者是密码子上的剪接位点失活突变，该突变在肾上腺皮质癌和胰腺癌也曾被检测到。翻译延长因子EEF1A1基因在10位患者中有突变，其中5位患者均为S432I/S突变，这在HCC和其它肿瘤中也曾观测到。另外6个基因分别是AZIN1、RP1L1、GPATCH4、CREB3L3、AHCTF1和HIST1H1C，这些基因在HCC和其它肿瘤中均未报告过。

除了MutSigCV软件鉴定的显著突变基因外，还有两个基因在MutSigCV软件中计算的q值接近0.1，但也是高频突变基因。其中SF3B1在10位病人中有突变，该基因突变曾被报道过与驱动造血系统恶性肿瘤有关。另外还有11位病人的SMARCA4基因存在突变。

TERT启动子突变是最常见的体细胞突变。44%（87/196）的患者存在该突变。统计分析发现携带该突变的患者以年龄较大（p=0.0006）、男性（p=0.006）、倾向HCV阳性（p=0.04）和不倾向HBV阳性（p=0.02）为主。同时TERT启动子突变与启动子超甲基化沉默的CDKN2A高度相关。

通过对RNA数据分析发现，84%（37/44）由HBV感染造成的HCC患者都出现了HBV病毒整合到宿主基因组上并发生基因融合。这种整合增强了病毒的顺式激活功能抑制，抑制了宿主肿瘤调节基因的活性。大约50%的HBV整合位点都在宿主基因内部，即使只有MLL4和TERT两个基因是高频突变位点。

统计分析发现HBV感染的患者特征以亚洲人、年龄小、男性为主，而HCV感染的患者特征以白种人、黑种人和肝硬化患者为主。

2. 突变特征分析

图2  196位HCC患者标准化的特征结果层次聚类

       运用基于贝叶斯的非负矩阵分解NMF算法，共鉴定到3个独立的突变特征，其中两个与报道过的一致。同时对196位HCC患者标准化的特征结果进行层次聚类分析结果见图2。

3. 拷贝数变异分析

    图3     拷贝数变异和它们的分子、临床相关性

      使用GISTIC 2.0进行拷贝数变异分析，发现染色体1q和8q以拷贝数增加为主，8p和17p以拷贝数减少为主。共鉴定到了28个显著局部扩增的区域，这些区域包含了肿瘤驱动基因CCND1等。同时也鉴定到了36个缺失事件，包含了一些肿瘤抑制基因如ERRFI1的缺失。

4. DNA甲基化分析

图4     甲基化数据聚类结果

对显示肿瘤特异性甲基化的CpG位点进行无监督聚类，共确定了四个超甲基化簇，第3类和第4类均表现出高甲基化。聚类结果显示第3类包含了所有IDH1/2突变的患者，与之前的数据一致。第4类的比例异常多地富集了CDKN2A表观沉默、TERT启动子突变和CTNNB1突变的样本。亚洲种族以及HBV感染患者与第1类显著相关，而HCV感染者则与第4类显著相关。

采用2种不同的方法共鉴定到7个肿瘤特异超甲基化且下调表达的基因：CDKN2A、HHIP、PTGR1、TMEM106A、MT1M、MT1E、CPS1。此外共有298个基因表现出HCC特异性甲基化，其中81例甲基化曾被报道过，另有28例曾被报道在HCC或其它癌症中下调表达。

5. 多平台研究分子亚型

图5 多平台数据iCluster聚类结果

第一个亚型iClust1（n=65），主要以亚洲人、女性、正常体重为主，表现为肿瘤分级高、肝细胞癌的血管侵犯、Hoshida分类分数低。与另两类相比iClust1具有如下特点：CDKN2A沉默频率低（32%）、CTNNB1突变频率低（12%）、TERT启动子突变频率低且低表达。同时iClust1的MiR-181a高表达且miR-122表观沉默、增殖标记基因MYBL2, PLK1,  MKI67过表达。

相反的第二类iClust2（n=55）和第三类iClust3(n=63)表现出高频的CDKN2A甲基化沉默、高频的CTNNB1突变和TERT启动子突变、HNF1A突变富集。除此之外iClust2的临床特点为肿瘤分级等级低、较少的血管侵犯。iClust3还具有更高程度的染色体不稳定性、高频的TP53突变和多个CpG位点甲基化的特点。

 图6     测试数据的生存曲线图

随后挑选了200个变化最大的基因构建了预测模型，在其它3组数据中验证iCluster分组的临床意义，发现iClust1的预后均较差，说明这是一种可靠的临床结果预测手段。

6. 转录组数据分析

转录组数据分析发现IDH突变个体和类IDH突变个体的预后很差。miR-122在HCC患者中明显下调表达与预后差有一定联系。

图7     IDH1 / 2突变综合分析

7. 相关通路分析

图8      诱导的肝癌分子生物学特性聚类

对TP53靶基因进行聚类分析发现，TP53突变后有导致诱导基因的表达下调、抑制基因表达上调的趋势，且TP53靶基因低表达的样品表现出拷贝数不稳定缺失、更高的病理分级、成熟干细胞标记基因表达降低、肿瘤复发风险增加的特征，这些样品的预后也明显更差。其它关键通路(例如Wnt通路、细胞周期调控通路等)也都发现了基因的突变，这些基因也可能是靶向治疗的有效位点。

四     总结

文章通过基因组学、表观组学、转录组学和蛋白质组学分析的方法对肝癌进行全面综合分析，提高了我们对肝癌分子事件的理解，从而更好地了解可能改进治疗策略的分子靶点。许多确定的靶点表明单个靶点无法对所有或大多数的HCC起作用，最有效的治疗策略可能是针对多个靶点进行特定地治疗。

参考文献：

[1]Adrian Ally, Miruna Balasundaram, Rebecca Carlsen, et al. Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma[J]. Cell, 2017, 169（7）: 1327–1341.