【文章解读】个性化RNA疫苗：唤醒人体内的抗癌武器

德国科学家Ugur Sahin及其团队首次将一种以RNA为基础的个性化疫苗治疗方案应用于人体， 该疗法对每位病人基因组上检测到的突变进行新抗原预测，然后设计个性化疫苗。通常，自然条件下的免疫系统识别癌细胞的效率极低，而他们所提出的这种疫苗能够激发免疫系统，以一种靶向性的方式来对抗肿瘤。

文章题目：Personalized RNA mutanome vaccines mobilizepoly-specific therapeutic immunity against cancer

研究团队： 德国Mainz大学Ugur Sahin教授领导的研究团队

发表时间：2017.07

期刊名称：Nature

影响因子：40.137

研究背景

免疫治疗（immunotherapy）是指机体对抗原的识别能力低下，通过人为的增强或抑制机体的免疫功能来达到治疗疾病的目的。自然条件下人体免疫系统识别肿瘤细胞的效率极低，因此德国科学家Ugur Sahin及其团队介绍了个性化肿瘤疫苗的概念，采用了一种基于RNA的多重表位方法，激活免疫系统来对抗肿瘤。研究人员利用了10个突变位点的遗传信息来实现合成过程，使得能够在几个地方同时攻击肿瘤，确保了肿瘤无力进行抵抗。此次研究首次应用在人体黑色素瘤中。

研究方法

样品选择：符合具有完全缓解、部分缓解或疾病稳定的恶性黑色素瘤III期或IV期的13位成年人。

实验及分析方法：

1. 高通量测序

1. 构建DNA和RNA文库。

2. 制备MZ-γ氨基丁酸-018和匹配的PBMC的全基因组测序的NGS文库。

3. 使用Illumina TruSeq PE集群套件的v3-cBot-HS对DNA和RNA末端进行测序。

2. 生物信息学和突变检测

1. 使用Python编程语言实现突变相关数据的分析。

   DNA文库>150 x 106reads，RNA文库>75 x 106reads

2.  采用bwa将DNA读数与参考基因组hg19进行比对。

3. 新表位优先排序及选择

1. 采用基于预测的HLA I类结合进行排序。

2. 基于MHC I和MHC II结合预测来评估靶肽的靶标选择板。

4. Sanger测序

1. 采用Sanger测序技术对引物进行设计。

5. 体外转录RNA的制备

1. 进行体外转录RNA的制备，并通过凝胶电泳和微流体毛细管电泳（Experion，Biorad）评估RNA的完整性。

6. 体外刺激PBMCs

1. 对外周血单个核细胞（PBMCs）刺激11天后，通过流式细胞术分析细胞。

7. 酶联免疫斑点（ELISpot）

1. 对细胞进行ELISpot测定之后，通过ImmunoCapture V6.3软件进行分析。

   将由突变的RNA或肽刺激的T细胞应答与对照RNA（萤光素酶）电穿孔的靶细胞或未加载的靶细胞进行比较。

8. 多聚体染色和数据分析

1. 用多聚体对细胞表面标记物和活-死细胞染色。

   BD LSR Fortessa SORP上获得染色后的细胞

9. 细胞内细胞因子染色

1. 对细胞内细胞因子（IL-2 MQ1-17H12，IFNγB27，所有BD和TNFαMab11 Biolegend）进行染色。

   在BD FACS Canto II（Becton Dickinson）上获得样品

10. 单细胞分选

1.   采用BD FACS Aria流式细胞仪（BD Biosciences）进行新抗原特异性T细胞的分选

11. 新表位特异性TCR的克隆

1. 进行来自单个T细胞的T细胞受体（TCR）基因的克隆。

2. 采用来自PBMC的总RNA进行TCR-α/β深度测序。

3. 在DNA文库中使用Typer Toolbox软件分析测序数据。

   每个样品的总TCR读数：1.1×106〜1.5×106reads

12. 定量RT-PCR

1. 采用实时PCR系统进行qRT-PCR.

2. 采用定量SYBR Green Real-Time PCR或TaqMan基因表达测定方法制备和分析样品

13. 免疫组织化学

1. 采用免疫组织化学技术进行抗原抗体反应

2. 对经过计算机断层扫描和手动预定义后的肿瘤采用计算机图像分析软件量化正常组织和坏死区域。

14. 患者P04中B2M损失的表征

1. 通过手动整理MZ-γ氨基丁酸-018与整合基因组学中的外显子比对结果来检测B2M基因座的缺失，并定义B2M上游的删除起始点。

15. 克隆HLA抗原

1. 将HLA抗原克隆到适当的体外转录（IVT）载体中。

16. RNA转移到细胞中

17. 肽

1. 使用重叠肽库：具有11个氨基酸重叠并由15mer合成的肽，其覆盖27mer新抗原序列（每个新抗原4个OLPs）或控制抗原序列。

18. 流式细胞术分析

1. 在BD FACSCanto II分析流式细胞仪（BD Biosciences）上进行流式细胞术分析。

2. 使用FlowJo软件（Tree Star）的第十版对获取的数据进行分析。

19. 细胞毒性测定

1. 基于荧光素进行细胞毒性测定。

2. 根据公式计算特异杀伤：

   

20. 细胞凋亡测定

1. 在37℃，5％CO2下，使用IncuCyte Zoom Live-content成像系统将细胞放大十倍。

2. 使用IncuCyte分析软件分析数据，以检测和定量每个图像的凋亡（绿点）细胞。

3. 使用GraphPad Prism软件绘制平均绿点数（凋亡数）。

研究结果

a. 通过免疫接种广泛动员突变特异性免疫

 图1 通过免疫接种广泛动员突变特异性免疫

①观察到疫苗经皮正常给入人体后，在自身树突细胞的ELISpot测定读数中检测到60％预测的新表位的反应，表明受试的13位患者中每位患者的T细胞能对抗至少三个突变位点。

②观察到预先存在的针对三分之一的免疫原性新表位有弱免疫应答，但在接种疫苗后反应明显增强，而其他三分之二为初次应答，表明疫苗对于肿瘤免疫应答具有刺激作用。

③观察到免疫原性突变均匀分布在五聚体RNA的五个位置，大多数新表位在CD4 +应答，较小的部分被CD8 +细胞毒性淋巴细胞（CTLs）识别，表明了免疫原性突变位点缺乏位置偏倚。

④观察到大多数新表位疫苗诱导的反应没有或很少与用RNA编码的野生型表位转染的自体树突状细胞（DCs）交叉反应。

b. 通过疫苗接种使具有中枢和效应记忆表型的新表位特异性T细胞快速扩增

 图2    通过疫苗接种使得具有中枢和效应记忆表型的新表位特异性T细胞的快速扩增

①PBMCs的读取不需要预先扩增ELISpot中新表位 - RNA加载的自体树突状细胞，表明血液中五分之一的免疫原性突变反应在体外无刺激作用，而在接种新表位和共有肿瘤相关自身抗原的患者中新表位应答更强，可能是由于缺乏中枢免疫耐受。

②以活化诱导的γ干扰素-分泌为基础的单细胞经过分选得到CD8 + T细胞，经过体外刺激与新表位 - RNA负载的自体树突细胞经过TCR克隆，使用肽冲击细胞测试编码鉴定的TCR-α/β链的RNA与来自健康体的CD8 + T细胞，然后进行共转染。观察得到的新抗原特异性TCR的频率。在来自患者的接种疫苗前血液样品的TCR深度测序数据中未检测到新抗原特异性TCR序列，但在接种后的样品中含量丰富，证实CTL是首次诱导产生的。

③通过无RNA的树突状细胞与染色后的树突状细胞进行对照得出T细胞不仅具有弱的PD-1+、效应记忆表型并且还有完全功能的γ干扰素和TNFα伴随表达对抗原的刺激。

 c.    通过疫苗接种在高复发风险的黑素瘤患者中进行疾病控制

图3 通过疫苗接种在高复发风险的黑素瘤患者中进行疾病控制

①  统计受试患者复发、治疗和无进展的数据以及之后每月对新表位RNA疫苗接种的转移事件的累计总和， 证明了受试患者有复发的高风险。

② 通过比对没有转移事件的累积观察时间和事件发生月数的Fisher精确检验，和目标病变的计算机断层扫描以及ELISpot对P07的疫苗诱导的体外反应，表明新表位疫苗接种前后所有患者的黑色素瘤复发显示纵向累积复发转移事件（P <>

③ 观察到P17患者的疫苗诱导T细胞反应，表明疫苗激发了肿瘤免疫应答。

d.    新表位诱导的CTL反应与P04中B2M缺陷黑素瘤细胞的生长免疫逃逸相关。

图4 新表位诱导的CTL反应与P04中B2M缺陷黑素瘤细胞的生长免疫逃逸相关

①  针对HLA多聚体检测接种后病变的血液，和TIL中的两个新表位的CD8 + T细胞的频率，在不同条件下HLA删除和倒置使得基因组映射而导致B2M丢失。通过荧光素酶细胞毒性测定来测量新表位的TCR，最后转染转移黑素瘤细胞的B2M。在12例应用后，切除残留的转移灶，病理诊断几乎完全坏死，与预接种黑素瘤标本相比：CD8 + T细胞浸润、PD-L1染色、免疫激活和炎症标记物的表达均增加。

讨论

由于黑色素瘤具有多基因突变的性质，选用黑色素瘤作为实验对象让科学家有充足的机会选择合适的抗原。在13位接种疫苗的患者中，8人肿瘤完全消失且23个月内无复发，其余5名患者由于接种疫苗时肿瘤已经扩散，有2人出现肿瘤缩小，其中1人接受辅助治疗后肿瘤完全消退，证明了基于突变组学的个性化RNA疫苗的临床可行性、安全性和抗肿瘤活性。免疫治疗发挥了精准医疗的极致但是仍面临挑战——每个肿瘤都有独特的“指纹”，要研制出个性化的疫苗需要投入大量的时间与精力。

参考文献：

[1] Carmen Loquai, Özlem Türeci,et al.[J].Nature, 2017, 547: 222-226.