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文章题目：A Braf kinase-inactive mutant induces lung adenocarcinoma 研究人员：Experimental Oncology, Molecular Oncology Programme, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) 发表时间：2017. 06 期刊名称：Nature 影响因子：40.137 研究背景 在肺腺癌病人中，几乎有一半病人的最初致癌原因仍然是未知的，从而导致选择性靶向治疗的发展过程变得十分复杂。这些肿瘤中的很多突变并没有明显的致癌作用，包括BRAF失活突变。BRAF基因在其他类型的肿瘤中经常以BRAF V600E激活突变的形式发生突变，但在肺部相关肿瘤中却以失活突变的形式占据主导地位。 RAS-MAPK级联信号能够作为一种中心节点将来自膜受体的信号转导到细胞核内，这种通路在大部分人类癌症中往往处于异常激活的状态。研究发现种系突变会导致这种信号在一定程度上的激活，进而产生RASopathies这种发育障碍综合症。此外，还有大量研究结果表明， RAS-MAPK信号水平的上升会导致细胞毒性的产生，在肿瘤的早期发展过程中阻挡肿瘤的发展。研究人员还发现了在成年小鼠中通过遗传性地消除这个信号通路会导致小鼠的快速死亡。上述结果表明，明确RAS-MAPK活性的阈值对于内稳态以及恶性转化都是必需的，但仍需要可信的遗传学证据来证明。 研究方法 1.细胞株：KrasLSLG12Vgeo, Braf LSLD631A, Braf lox, Braf LSLV637E, Trp53lox/lox 2.小鼠：8-12周老鼠（雌雄均有） 3.肿瘤诱导和药物治疗：单气管内注射Cre重组腺病毒 4.组织病理学和免疫组化分析 5.细胞培养 6.计算机断层扫描（CT） 7.数字图像量化 8.统计和数据分析 研究成果 研究发现在表达Braf（D631A）的Kras G12V细胞系中，MAPK信号传导的强度和持续时间都有所增强，可能是由于Braf(D631A)-Craf异源二聚体独有的形成所引起的。因此，为了在体内产生强度在一定阈值范围内的MAPK信号，研究者将野生型Braf，条件敲除Braf lox和条件敲入Braf LSLD631A与可诱导的Kras LSLG12Vgeo等位基因（其中LSL表示lox-STOP-lox基序）组合。用表达Cre重组酶的腺病毒（Ad-Cre）气管内感染产生Kras + / LSLG12Vgeo（以下称为K），Kras + / LSLG12Vgeo ; Braf + / LSLD631A（KB）和Kras + / LSLG12Vgeo ; Braf lox / LSLD631A（KBL）细胞株。Cre重组酶介导这些等位基因的重组，进而诱导了不同程度的Ras-MAPK信号，其中Braf + / +诱导了较低的信号活性，Braf + / D631A诱导中等强度的信号活性，Braf - / D631A引发了最大程度的信号活性。通过这种方法，可以分析不同程度的MAPK活性对体内细胞转化，腺癌发生和细胞毒性的影响。 图1 结合野生型Braf，条件敲除Braf lox和条件敲入Braf LSLD631A来确定决定细胞转化和细胞毒性的MAPK活性的范围 肺细胞表达这些条件等位基因是通过Kras(G12V) 癌蛋白与一种具有β半乳糖苷酶活性的融合蛋白（β-geo）的共表达来鉴定的。通过包埋X-gal染色发现（图1），在Ad-Cre感染1个月后，可以很容易的在K型小鼠的肺中检测到小块的增生。通过对比发现Ad-Cre感染的KB小鼠有腺瘤的病灶同时伴随有较多的增生区域，这种病变在K型小鼠的早期阶段是非常罕见的。此外，研究者发现Ad-Cre感染的KBL型动物中几乎不存在X-gal+肺泡增生和腺瘤，这些小鼠最突出的特征是表现出了肥厚性支气管（图1a）。在KBL小鼠中，缺少由Kras G12V驱动的肺泡损伤的原因不太可能是由于BRAF失活所造成的，因为BRAF激酶在Kras G12V驱动的肺腺癌的发展过程中是可有可无的。因此，研究者推断没有肺泡损伤的原因可能是由于某种细胞毒性所引起的（例如衰老或DNA损伤这两种肿瘤发展过程中的障碍）。的确，早在Ad-Cre感染1周后，研究者已经从KBL小鼠肺裂解物等检测出p19 Arf和p53肿瘤抑制基因、活性胱天蛋白酶3和γ-H2AX（一种DNA损伤的标志物）（图1b，c），没有观察到衰老相关β-gal染色的差异。Erk1 / 2和p90Rsk磷酸化作用的共同增加表明，MAPK信号的增高引发了损害肿瘤细胞增殖的应激反应。然而，最近已经报道了突变型Kras驱动的肺腺癌显示出对DNA损伤应答的弥补作用，进而防止基因毒性的应激反应。研究者认为可能是由于KBL小鼠中Braf（D631A）-Craf复合物的排外形成超过了这种毒性信号阈值，继而产生阻碍肿瘤发展的应激反应。以上研究结果表明，Ras致癌毒性是由MAPK定量决定的。Mek抑制剂抑制了Ad-Cre感染KB小鼠的肿瘤生长，同时以剂量依赖的方式恢复了KBL动物的毒性表型，并在中等药物浓度下恢复了肿瘤进展，这很可能是通过抑制MAPK活性到与细胞增殖相适应的水平实现的（图1 d）。这与观察到的原发性细胞中RAS诱导的衰老被MEK和ERK激酶的抑制，进而被忽略的现象相一致。这些观察结果表明，Kras G12V驱动的肺肿瘤细胞只能在有限的MAPK活性范围内增殖，而过量的MAPK活性诱导DNA损伤产生细胞毒性，少量的MAPK活性也不能维持肿瘤的生长。 图2 同时表达Kras(G12V)和Braf(D631A)突变的小鼠的具有较短的生存期；Craf激酶的活化可以介导肿瘤的发展过程 随着时间的推移，继续跟踪Ad-Cre感染的K，KB和KBL小鼠队列。与较早的发病和较快的肺泡病变进展一致，KB动物的生存期显著缩短（图2 a）。在Ad-Cre感染6个月后，与K对照相比，肺组织病理学分析显示，KB型动物的肿瘤负荷增加了7.5倍（图2 b）。此外，KB小鼠表现为晚期腺癌，在Kras G12V单独驱动的肿瘤中，很少在这个时间进入这个阶段（图2 c）。存在于KB小鼠中的肿瘤显示的SPC + CC10-免疫染色表明，如同仅由致癌因素Kras驱动的腺癌那样，KB小鼠中的腺癌可能是由肺泡II型细胞（AT2）起源的（图2d）。总之，这些观察结果表明，由Kras（G12V）和Braf（D631A）突变共存所产生的MAPK超活化现象会增强AT2细胞的转化作用并加速肿瘤的进展过程。 MAPK悖论的活性模型假定所观察到的肿瘤表型是由CRAF激酶活性介导的，为了验证这一假设，研究者在KB小鼠添加了条件性敲入Craf（也称为Raf1）激酶失活等位基因（Craf LSLD468A）。所得细胞株Kras + / LSLG12Vgeo ; Braf + / LSLD631A ; Craf LSLD468A / LSLD468A（称为KBC KD）用于确定Craf激酶的遗传抑制是否可以恢复KB小鼠已经显示出的较强的肿瘤表型。Craf（D468A）激酶失活同工型的表达导致磷酸化（p-）Erk1 / 2和整体肿瘤负荷水平的显著降低，相较于KB小鼠显著延长了KBC KD小鼠的生存时间（图2e，f）。类似地，Craf缺失（KBC L小鼠）也延长了存活的时间（图2 g）。这些结果表明在KB动物中肿瘤负荷的增加和腺癌进展的加快是由于Craf介导的MAPK信号传导的激活。 与KB小鼠相比，KBL队列的肿瘤负荷显著降低，表明在不表达野生型Braf的情况下，过高的MAPK活性可能对肺腺癌发展是不利的。然而，尽管KBL动物的肿瘤负荷减少，其生存时间却与KB小鼠相同（图2 a，b）。对KBL小鼠的肺进行详细检查发现了内侧支气管癌（45%），这种癌症在K型小鼠中没有发现，在KB小鼠中仅发现20例（14%）(图3a)。使用Ttf1和SPC等标志物的集合进行免疫染色，结果未能明确这些细支气管内病变的起源，因为所得到的表达模式与预期的两种肿瘤类型并不符合（图3b）。 图3 MAPK信号的过度活化可以通过细支气管外分泌细胞的分化转移的方式进而导致细支气管癌的发生 为了进一步阐明这些细支气管内损伤的起源，研究人员用系列特异性病毒Ad-CC10-Cre（细支气管外分泌细胞）或Ad-SPC-Cre（肺泡II型细胞）感染K,KB和KBL小鼠，进行体内追踪实验。在Ad-SPC-Cre感染后，小鼠的肺分析显示：相较于K小鼠，在KB小鼠中存在更大和更丰富的腺瘤，KBL小鼠主要发展为不能进展到晚期阶段的肺泡增生。此外，Ad-CC10-Cre感染在K或KB小鼠中没有诱导肿瘤生长，但在KBL动物中诱导了丰富的SPC+内支气管癌（图3 d，e）。研究结果说明了对AT2细胞有毒性的一定活性范围的MAPK信号会导致支气管内细胞的有效转化作用。总之，上述结果说明了一定活性的MAPK信号控制了Kras致癌基因驱动肺癌形成过程中的方方面面。 表1 此外，一些研究发现一部分的BRAF失活突变（11％）与上游RAS突变共存（表1）。因此，研究人员对Braf（D631A）激酶失活突变在KrasG12V驱动的肿瘤中的表达是否促进肿瘤进展进行了研究。在Flp重组酶驱动的肺肿瘤模型中添加了Braf LSLD631A等位基因，产生了Kras+/ FSFG12V ; Tg.hUb-cre-ERT2 + / T ; Braf + /LSLD631A（KFB）细胞株。在已有的Kras G12V驱动型肿瘤中Braf（D631A）激酶失活同工型通过促进病灶的加速进展，进而导致存活率降低（图4 a）。以上结果为在一些肺腺癌中致癌KRAS突变和BRAF失活突变同时发生提供了实验依据，也为目前的临床指示I类RAF抑制剂（威罗菲尼等）不应该在KRAS突变的肺腺癌病人中使用提供了依据。 图4 内源性Braf D631A活化导致了肺腺癌的发展 然而，人类肺癌中的大部分（89%）BRAF失活突变不与RAS突变共存。为了评估Braf失活突变体是否可以在没有Kras突变的情况下诱导肺腺癌形成，研究者用Ad-Cre在气管内感染了Braf + / LSLD631A小鼠。感染后12个月的肺部分析显示，22只小鼠中有9只发生肿瘤（41％发生率），而Kras + / LSLG12Vgeo组中18例（78%）中有14例发生肿瘤。所研究的所有肿瘤均显示出具有SPC + CC10-免疫染色的肺腺癌的组织学特征（图4b和扩展数据图6a）。值得注意的是，在Braf D631A驱动型肺腺癌，p-Erk1/2水平高于Braf V637E（相当于人类BRAF V600E） ，Kras G12V或Kras G12V; Trp 53 - / -肿瘤（图4 c）中p-Erk1/2的水平。此外，研究人员确定了这些肿瘤中没有Ras突变（数据未显示）。 总结 该研究证明小鼠内源性Braf（D631A）激酶失活同工型（对应于人BRAF（D594A）突变）的表达在体内导致了肺腺癌的发生，表明BRAF失活性突变是肺癌发生过程中的起始事件。此外，在一些KRAS驱动突变型肺癌中，也鉴定到了BRAF失活突变。Kras（G12V）和Braf（D631A）在小鼠肺细胞中的共表达显著增强了肿瘤的起始反应，这种现象可以通过CRAF激酶活性进行调节。研究还发现了野生型Braf激酶在维持Kras（G12V）/ Braf（D631A）驱动的肿瘤中具有重要的作用。野生型Braf等位基因的消除可以通过诱导致癌毒性的MAPK信号的增加进而阻止肺腺癌的发展，这种影响可以通过Mek的药理学抑制来消除，来恢复肿瘤的生长。然而，野生型Braf的缺失也引起细支气管外分泌细胞的分化转移，导致致死性细支气管内病变的快速发展。以上研究结果表明，MAPK通路的信号强度不仅是在肿瘤发生发展过程中的关键决定因素，而且在决定诱发癌症开始时细胞的性质以及确定最终肿瘤表型等方面也起到了重要的作用。 参考文献： [1] Patricia Nieto, Chiara Ambrogio, Laura Esteban-Burgos, et,al.A Braf kinase-inactive mutant induces lung adenocarcinoma[J].Nature, 2017,548, 239–243 .
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