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研究人员利用单细胞RNA-seq这一相对较新的方法，每次一个细胞地研究整个肿瘤以便确定哪些类型的细胞存在于肿瘤中。他们不仅分析了恶性肿瘤细胞，也分析了肿瘤内所有不同类型的细胞。这是首次开展这样的研究，该研究为揭示肿瘤的多样性细胞环境提供帮助。 文章题目：Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma bysingle-cell RNA-seq 研究人员：来自麻省理工学院的研究人员 发表时间：2016.04 期刊名称：Science 影响因子：37研究背景 为了探索黑素瘤肿瘤的不同基因型和表型状态，研究人员对从19位患者中分离出的4645个单细胞进行单细胞RNA测序，区分其中的恶性，免疫，基质和内皮细胞。同一肿瘤内的恶性细胞表现出与细胞周期，空间环境和抗药性程序相关的转录异质性。而且所有的肿瘤都有两种不同转录模式，使得高表达MITF的肿瘤也会含有低表达MITF和高表达AXL激酶的细胞。单细胞分析能够分析不同的肿瘤微环境模式，包括细胞与细胞的相互作用等。肿瘤浸润T细胞的分析揭示了T细胞的耗竭过程，耗竭过程与T细胞活化和克隆扩展的联系，以及患者之间变异性等特点。该项研究为解开肿瘤的细胞生态系统，以及单细胞基因组学如何助力靶向治疗和免疫治疗这一问题提供了线索。 研究方法 样本选择 研究人员对19个黑色素瘤肿瘤的4645个恶性、免疫和基质细胞进行单细胞测序，这19个样品来源包括淋巴组织10例（淋巴结9例，脾1例），皮下或肌肉组织5例，胃肠道3例，原发性肢端黑素瘤1例。19个肿瘤中的17个已经有基因分型信息，其中4个在BRAF中具有活化突变，在NRAS癌基因中有5个;8名患者有BRAF/NRAS野生型的黑色素瘤。 单细胞测序流程 为了分离适合高质量单细胞RNA-seq的活细胞，研究人员开发了快速转录分析的工作流程。他们在手术采集后立即处理肿瘤组织并在约45分钟内产生单细胞悬液，尽量避免由分解聚集，温度或时间引起的人为转录变化。一旦处于悬浮状态，研究人员就开始通过流式细胞术（荧光激活细胞分选）分选免疫（CD45+）和非免疫（CD45-）细胞（包括恶性和基质细胞）。并反转录获取单细胞cDNA，构建文库以及测序。每个细胞的平均read约为15万；另外恶性细胞里有4659个基因表达，而免疫细胞则是有3438个基因表达。 图1 流程概览 研究成果 单细胞转录组谱区分恶性和非恶性细胞的细胞状态 研究人员采用基因和转录状态来区分黑素瘤肿瘤内的不同细胞类型。通过在各自的染色体上延伸100个基因的表达量进行CNV（15）（图2B），而CNV的非整倍性的细胞可分类为恶性细胞。因此能将单细胞分为恶性细胞和非恶性细胞。其次，对细胞的表达谱进行数据降维(t-SNE)和密度聚类。恶性细胞分成了6个单独的簇（图2C），表明高度的肿瘤异质性。相反，非恶性细胞由细胞类型聚类。B细胞，巨噬细胞，内皮细胞，癌症相关成纤维细胞（CAFs）和自然杀伤细胞都有其特异表达基因作为mark来识别（图2D）。 图2 恶性和非恶性细胞的细胞状态分类 恶性细胞的异质性 接着研究人员对恶性细胞进行了分析，来鉴定生物相关的黑素瘤细胞状态。他们先进行了主成分分析（PCA），得到了六个主要成分。 第一种成分与每个细胞检测到的基因数量高度相关，可能反映技术方面的问题；而其他五个重要的主要成分突出生物变异性。 第二种成分（PC2）与细胞周期基因的表达有关。细胞周期阶段G1/S或G2/M期相关的signature基因在恶性细胞亚群中高度表达。根据这些signature基因能将肿瘤细胞分类为低循环（1至3％，Mel79）和高循环肿瘤（20至30％，Mel78），说明肿瘤周期细胞部分的变异性，与Ki67+染色结果一致（图3B）。 其中值得注意的是细胞周期蛋白D3（CCND3）仅存在于高周期性肿瘤的周期性细胞(cycling cells)中。相反，KDM5B（JARID1B）与非周期性细胞（图3A，绿色圆点）显示最强的相关性，与小鼠和体外模型中的观察结果一致（图3C）。 第三种成分和第六种成分（PC3和PC6）主要从一种未治疗的肿瘤（Mel79）中分离不同的恶性细胞。 图3 细胞周期异质性 综合上述观察结果，治疗前黑素瘤可能存在靶向治疗无效的亚群。PC4和PC5与MITF基因表达量高度相关，MITF（小眼相关转录因子）是皮肤中黑色素细胞的主要调节基因。研究人员在这两个亚群里发现了两个基因组合。其中MITF本身和几种MITF靶基因（包括TYR，PMEL和MLANA）组成的“MITF高表达”组合基因。第二个“AXL高表达”组合基因，与“MITF高表达”组合基因呈负相关，该组合包括AXL和NGFR基因，这些基因是各种靶向治疗耐药的标志物和推断黑色素瘤干细胞的标志物。通过这两个组合可区分黑素瘤肿瘤，细胞系，和鼠标模型，另外“AXL高表达”与RAF和MEK抑制的内在抗性有关。 在大肿瘤水平，每个黑色素瘤可以分为“MITF高表达”或“AXL高表达”的其中一种模式。（图4A），但在单细胞水平上，每个肿瘤都含有对应于两种转录状态的恶性细胞。使用单细胞RNA-seq检查含有MITF、AXL基因的细胞表达情况，观察到MITF高表达的肿瘤（包括未经治疗的黑色素瘤）含有AXL高表达的黑色素瘤细胞的亚群，也就是说MITF和AXL在一个细胞中同时高表达，反之亦然（图4B）。这是通过非单细胞测序检测不到的，例如在整体肿瘤分析中，通过IF染色，MITF-high和AXL-high的表达相互排斥的，是观察不到单细胞水平的表达情况的（图4C）。因此，在每个肿瘤中，恶性细胞在AXL和MITF高转录状态之间是连续的（图4B）。 由于AXL和MITF高转录状态的恶性细胞在黑色素瘤中共存，研究人员通过耐药性实验证明用RAF和MEK抑制剂治疗会增加“AXL高表达”细胞在耐药性发展后的发病率。 图4 耐性肿瘤异质性 非恶性细胞及其在黑色素瘤微环境中的相互作用 各种非恶性细胞构成肿瘤微环境。微环境的组成对肿瘤发生以及治疗反应的调节具有重要作用。例如，T细胞的肿瘤浸润可预测各种癌症类型对免疫检查点抑制剂的反应。 为了确定黑色素瘤微环境的组成，研究人员用单细胞RNA-seq表达谱的signature基因得到五种分类：T细胞，B细胞，巨噬细胞，内皮细胞和CAF。并使用这些signature基因来推断整体肿瘤中5种细胞类型的相对丰度（图5A）。研究发现肿瘤纯度与DNA分析预测有很强的相关性（相关系数R〜0.8）（图5A，热点图下面的第一条泳道）。 研究人员根据其推断的细胞类型组成将471个来自TCGA的肿瘤分成10个不同的微环境簇（图5A）。除了一些例外（例如，簇8和9）外，簇主要独立于转移部位。 那么，这些不同的微环境如何与恶性细胞的表型相关？ 特别是CAF丰度可以预测不同AXL-MITF模式，CAF富集的肿瘤细胞具有AXL-high的特征。MITF-high特征的肿瘤细胞与CAF丰度呈负相关。CAF的表达与肿瘤细胞之间的相互作用有很大的关联。另外，黑色素瘤细胞和CAF均高表达AXL。 细胞之间的相互作用在肿瘤微环境中起着至关重要的作用。为了评估细胞间相互作用如何影响肿瘤组成，研究人员开发了影响或反映肿瘤中不同类型细胞比例的细胞表达的基因。其中补体因子3（C3）水平（CAF表达的补体基因之一）与CD8+T细胞浸润之间有高相关性（R>0.8）。研究人员对原发性肿瘤，转移性病变，正常皮肤和邻近肿瘤以及健康皮肤对照在内的308个核心活检组织（图5C）进行了双重IF染色和定量载玻片分析（图5C），与根据黑色素瘤样本分析的结果一致，补体因子与许多癌症类型中的T细胞丰度的推断相关，并且比正常组织更高。尽管相关分析不能确定因果关系，但这表明细胞与细胞间相互作用存在潜在的体内作用。 图5 非恶性细胞分类 肿瘤浸润T淋巴细胞的多样性及其功能状态 TILs，特别是CD8+T细胞的活性是免疫监视的主要决定因素。在正常情况下，暴露于抗原和共刺激因子的效应CD8+T细胞可能有介导恶性细胞裂解和控制肿瘤生长的功能。然而，这种功能可能会受到肿瘤介导而耗竭，从而T细胞不能激活细胞毒性效应功能。通过在T细胞表面（PD-1，TIM-3，CTLA-4，TIGIT，LAG3等）上刺激检测点分子来促进疲劳。检查点机制的阻断已经在黑素瘤和其他恶性肿瘤的亚群中显示出临床益处，但是对于免疫检查点阻断治疗，目前没有找到临床反应的生物标志物。而通过单细胞分析可能找到的决定因素，并可能找到新的免疫治疗靶点。 研究人员分析了来自15个黑素瘤的2068个T细胞的模式（图6A）。鉴定了T细胞及其主要亚群[CD4+，调节性T细胞（Treg）和CD8+]。在CD4+和CD8+群体中，PCA根据初始和细胞毒性T细胞基因的表达（图6A和B）区分细胞亚群和活化状态的异质性。而耗竭基因表达也与细胞毒性标记物和总体T细胞活化状态的表达高度相关（图6B）。 我们使用Mel75 来估计每个单元的耗尽状态。耗竭状态被定义为耗竭基因相对于细胞毒性基因具有高或低表达（图6D）。实验确定了28个基因核心耗竭基因，这些基因在大多数肿瘤的高度耗竭细胞（包括共抑制（TIGIT）和共刺激（TNFRSF9/4-1BB和CD27）受体）中持续上调（图6E）。这些肿瘤特异耗竭基因的表达量可以反映免疫治疗前后的效果。 最后，研究人员分析了T细胞状态与克隆扩增之间的关系。识别肿瘤抗原的T细胞可能增殖，产生可辨别的由相同T细胞受体（TCR）序列定义的克隆亚群。为了鉴定潜在扩增的T细胞克隆，我们使用RNA-seq读数，将其映射到TCR，通过它们的a和bTCR链的V和J片段的同源性对单个T细胞进行分类 。在Mel75中大约一半的CD8+T细胞具有确定的七种富集组合中的一种（FDR=0.005），因此可能代表扩大的T细胞克隆（图6G）。这种假定的T细胞扩张也与衰竭有关（图6H），使得扩张的T细胞（具有多于六个细胞的TCR簇）中的低耗竭T细胞被消耗，并且富集非扩张的T细胞。特别是，非耗竭的毒性细胞几乎都是非扩增的细胞（图6H）。总的来说，这个分析表明，单细胞RNA-seq分析结果可能支持功能可变的T细胞群这一推断，其他方法不能都检测到。以上结论有利于肿瘤治疗以及免疫检查点抑制剂抗性研究。 图6 肿瘤浸润T淋巴细胞的多样性及其功能状态 总结 在此之前，科学家们大多数进行“大体积（bulk）”肿瘤测序，特别是为了研究整块肿瘤组织，利用RNA测序（RNA-seq）或DNA测序（DNA-seq）分析癌症基因组或转录组。尤其是对RNA-seq而言，对整块肿瘤组织进行分析受到限制，这是因为人们研究的是肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的混合物，所有的这些细胞混合在一起，它们可能会或可能不会导致癌症恶化和耐药性。 在这项新的研究中，研究人员利用单细胞RNA-seq方法每次一个细胞地研究整个肿瘤以便确定哪些类型的细胞存在于肿瘤中。他们不仅分析了恶性肿瘤细胞，而且也分析了肿瘤内所有不同类型的细胞。这是首次开展这样的研究。如今，他们知道每种肿瘤的细胞组成，也知道每种类型的细胞的基因表达模式，这样就能够回过头去重新分析一些大体积肿瘤测序数据（比如，癌症基因组图谱），以便从现存的数据中找出细胞如何相互作用和一定程度上利用细胞重建大块肿瘤样品的整体行为。 单细胞RNA-seq是一种相对较新的方法，但是它可能有助解决与肿瘤中细胞多样性相关的问题。主要原因在于理解这种多样性：当医生治疗癌症时，一些病人对治疗作出反应，而其他病人不会，而且即便对治疗作出较好的反应，癌症也经常会复发。人们也并不理解为何一些细胞可能被杀死，而其他的细胞可能不会被杀死，但是人们猜测这种差异与肿瘤环境中的细胞多样性存在关联。 参考文献： [1] Itay Tirosh,Benjamin Izar, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma bysingle-cell RNA-seq[J]. Science, 2016,352(6282): 189–196. |
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