文章解读 | 单细胞转录组分析揭示原发复发头颈癌生态系统

肿瘤中的多种恶性细胞、间质细胞和免疫细胞影响肿瘤的生长、转移和对治疗的反应。研究者描述了来自18个头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的6000个单细胞的转录组，其中包括5对匹配的原发性肿瘤和淋巴结转移瘤。基质细胞和免疫细胞在患者中具有一致的表达程序。相反，肿瘤内和肿瘤之间的恶性细胞在与细胞周期，应激，缺氧，上皮分化和部分上皮间质转化（p-EMT）相关的特征表达有所不同。表达p-EMT程序的细胞在空间上定位于原发肿瘤的边缘。通过将单细胞转录组与整体表达谱整合到数百个肿瘤中，研究者通过它们的恶性和基质组成来优化HNSCC亚型，并将p-EMT作为淋巴结转移、分级和不良病理学特征的独立预测因子。研究者的研究结果提供了对HNSCC生态系统的了解，并定义了与转移相关的基质相互作用和p-EMT程序。

文章题目：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer

研究人员：来自麻省总医院、哈佛大学、Broad研究院

发表时间：2017. 12. 14

期刊名称：Cell

影响因子：30.41

研究背景

基因组学和转录组学研究揭示了人类肿瘤主要的驱动突变，异常调节程序和疾病亚型。然而，这些研究依赖于大量测量肿瘤的分析技术，限制了其捕获肿瘤内异质性的能力。大量的证据表明恶性和非恶性细胞之间的肿瘤内异质性及其在肿瘤微环境（TME）内的相互作用对肿瘤生物学的各个方面是关键的。单细胞基因组学的最新进展提供了探索细胞分辨率的遗传和功能异质性的途径。人类肿瘤，循环肿瘤细胞（CTC）和患者来源的异种移植物的单细胞RNA测序（scRNAseq）研究揭示了对肿瘤组成，癌症干细胞和耐药性的新观点。然而，尽管上皮肿瘤占优势，scRNAseq研究并没有深入地表征它们。在这些肿瘤中，向引流淋巴结（局部转移）和其他器官（远处转移）的转移是导致高发病率和死亡率的主要原因。转移瘤常常是根据原发肿瘤的分子和病理特征进行治疗的，由此提出了它们是否具有相同的遗传学，表观遗传学和脆弱性的问题。然而，原发性肿瘤和转移瘤的潜在不同组成阻碍了大块肿瘤组织的直接比较。原则上，单细胞表达谱分析研究将提供令人信服的选择。 

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种与酒精和烟草暴露密切相关的具有异质性的上皮肿瘤。患者往往在晚期出现的淋巴结转移（LN），凸显转移仍然是一个核心挑战。在这里，研究者研究原发性头颈部鳞状细胞癌和匹配的淋巴结转移，以更好地了解瘤内异质性，侵袭和转移。来自18位患者的rv6000细胞的转录谱揭示了区分不同恶性，间质和免疫细胞的表达机制。恶性细胞在细胞周期，压力，缺氧和上皮分化过程中表达有所不同。一部分细胞也表达了部分EMT（p-EMT）程序与细胞外基质蛋白，但缺乏经典的EMT转录因子（TFs）。p-EMT细胞被定位于原发癌的边缘，其中原发癌和“癌相关成纤维细胞”（CAF）也邻近。研究者利用HNSCC生态系统的知识来重新评估来自癌症基因组图谱（TCGA）的大量RNA-seq数据。这为HNSCC表达亚型的相关研究提供了新见解和思路，并将p-EMT程序建立为不良临床特征（包括侵袭和转移）的独立预测因子。

图1 头颈鳞癌单细胞RNA测序表征瘤内表达异质性

研究方法

样本选择：

• 600个来自HNSCC样本的单细胞

• 5个HNSCC细胞系

研究成果

HNSCC原发肿瘤和转移瘤的单细胞表达图谱

为了探索HNSCC肿瘤的细胞多样性，研究者关注了HNSCC最常见的亚型：口腔肿瘤。研究者为来自18名未接受治疗的患者的原发性肿瘤进行scRNA-seq获取表达谱，并对其中五名患者的LN转移执行同样的操作。研究者还获得了这些肿瘤的全外显子组测序（WES）和靶向基因分型（SNaPshot）数据，这些数据显示了一系列可能的驱动突变和染色体变异，与已建立的HNSCC基因组特征保持了一致。

在最初的质量控制后，研究者保留了来自18名患者的5,902个细胞的单细胞转录组。研究者自信地通过三种补充方法来区分2215个恶性细胞和3363个非恶性细胞。首先，研究者根据跨染色体间隔的平均表达谱推断每个单细胞中的大规模染色体拷贝数变异（CNV）。这些推断的CNVs与WES一致，通过推断的CNVs将恶性细胞从正常核型的非恶性细胞中分离出来。其次，研究者通过其上皮来源鉴别恶性细胞，其不同于TME中的基质和免疫细胞。研究者发现在具有上皮标志物表达的细胞和具有异常核型的细胞之间具有显著的一致性。最后，研究者通过它们的全局表达模式将细胞划分到初始簇。基于CNV和上皮标志物分析，绝大多数细胞均被分到具有一致恶性或非恶性分类簇中去。

头颈部癌症的表达异质性景观

非恶性细胞的单细胞概况揭示了肿瘤微环境（TME）的组成。研究者通过它们的表达状态将3,363个非恶性细胞分成八个主要簇。根据已知标记基因的表达，对B细胞，巨噬细胞，树突状细胞，肥大细胞，内皮细胞，成纤维细胞和肌细胞这八个簇进行注释。值得注意的是，每个簇含有来自不同患者的细胞，表明TME中的细胞类型和表达状态在HNSCC肿瘤中基本一致，并且不代表患者特异性亚群或批处理效应，尽管它们的比例是不同的。由于研究者的数据集中T细胞和成纤维细胞数量相对较多，研究者通过更精确的聚类发现了T细胞和成纤维细胞的多样性。主要T细胞簇（rv1000个T细胞）可以分为四个亚群，研究者注释为调节性T细胞（Treg），常规CD4 + T辅助细胞（CD4 + Tconv）和两种细胞毒性CD8 + T细胞群（CD8 + T和CD8 + Texhausted）。细胞毒素亚型在共抑制性受体（例如PD1，CTLA4）和与T细胞功能障碍和衰竭相关的其他基因的表达方面不同，并由此定义HNSCC中推定的T细胞耗竭程序。耗竭CD8 + T细胞的部分在研究者的队列患者中显著变化。这些T细胞表达状态可以为理解和预测检查点免疫疗法的反应提供帮助。

尽管研究人员对人类肿瘤中成纤维细胞有很大的兴趣，但其调节状态仍不清楚。 rv1,500成纤维细胞分成两个主要子集，一个第三次要子集。一个子集表达肌成纤维细胞的经典标记，包括α平滑肌肌动蛋白（ACTA2）和肌球蛋白轻链蛋白（MYLK，MYL9）。肌成纤维细胞是TME的成熟组分，并与伤口愈合和挛缩有关。第二个子集表达与CAF相关的受体，配体和细胞外基质（ECM）基因，包括成纤维细胞活化蛋白（FAP），podoplanin（PDPN）和结缔组织生长因子（CTGF）。第三个子集基本不包括肌成纤维细胞和CAF的标记物，并可能代表处于静止状态的成纤维细胞。这些不同的成纤维细胞表达状态在肿瘤中可重现地被检测到，并因此可代表HNSCC TME的共同特征。

尽管CAF的细胞特征和起源已被归于各种谱系，但是研究者检测到的亚群与成纤维细胞特征高度一致。进一步的分析将CAFs（第二个子集）分为具有立即早期应答基因（例如JUN，FOS），间充质标志物（例如VIM，THY1），配体和受体（例如FGF7）差异表达的两种类型（CAF1和CAF2），TGFBR2 / 3）和ECM蛋白质（例如MMP11，CAV1）。这种瘤内CAF异质性与TMF中涉及复杂结构和旁分泌相互作用的观点一致。

与非恶性细胞相比，2215恶性细胞根据其起源的肿瘤聚类。超过2000个基因优先在个体肿瘤中表达。差异表达的基因在肿瘤之间不同的CNV内富集。其他差异与肿瘤亚型有关（参见以下通过大量表达数据解卷积精制的HNSCC亚型）。例如，在研究者的队列中，与解毒和药物代谢有关的基因（例如，GPX2，GSTM，CYP，ABCC1）优先由两种经典亚型肿瘤表达。最后，其他差异表达的基因与应激（例如JUNB，FOSL1）或免疫激活（例如IDO1，STAT1，TNF）有关，可能对不同的TME有反应。因此，肿瘤间恶性细胞表达异质性反映了研究者队列中肿瘤之间遗传学，亚型和TME的差异。

恶性肿瘤瘤内表达的异质性

接下来研究者探讨了同一肿瘤内不同恶性细胞之间的表达状态如何变化，重点讨论获得恶性细胞转录组最多数量的10对肿瘤样本。研究者使用非负矩阵分解来揭示在恶性细胞亚群中得到优先共同表达的一系列基因。例如，对于MEEI25恶性细胞，研究者定义了6个不同的基因特征。对10个肿瘤样本中的每一个都应用该方法，共定义了60个基因特征。接下来，研究者使用层次聚类来将这些60个特征提取成元特征，这些元特征反映了在多个肿瘤内变化的常见表达程序。来自不同肿瘤的特征之间的高一致性表明它们反映了肿瘤内表达异质性的共同模式。

图2  头颈鳞癌生态系统中恶性细胞和非恶性细胞的表达异质性

在至少两个肿瘤中，七个表达程序优先由恶性细胞亚群表达。两个程序反映了细胞周期的G1 / S和G2 / M期，并在每个肿瘤中鉴别出周期细胞（不同肿瘤中14％-40％的细胞）。第三个程序包括JUN，FOS，以及涉及细胞激活和应激反应的早期基因。第四个程序富含缺氧反应相关基因，并且在缺氧条件下培养的HNSCC细胞中数量增加。

另外两个程序主要由上皮基因组成，如EPCAM，细胞角蛋白（例如KRT6,16,17，75）和激肽释放酶（KLK5-11）。虽然所有的恶性细胞都表达上皮标记物，其中许多在恶性细胞中大部分是均一的，但这些特定上皮基因的表达在恶性细胞中是不同的，并且可能反映了上皮分化程度。最终的表达程序包含与ECM相关的基因，并具有EMT的特征。这个程序在所检查的10个肿瘤中的7个细胞亚群中是明显的。

HNSCC中的p-EMT程序

尽管EMT程序被广泛认为是耐药，侵袭和转移的潜在驱动因素，但它们在人类体内上皮肿瘤中的模式和意义仍不清楚。因此，研究者仔细检查了ECM计划中EMT的特征。除ECM基因如基质金属蛋白酶，层粘连蛋白和整联蛋白外，该程序还包括EMT标志物波形蛋白（VIM）和整联蛋白α-5（ITGA5）。此外，该方案中得分最高的基因之一是转化生长因子（TGF）-b诱导（TGFBI），暗示经典的EMT调节剂TGF-b。

图3  HNSCC中的p-EMT程序

虽然该程序具有经典EMT的关键特征，但缺乏其他标志。首先，虽然特征伴随着某些上皮基因的表达降低，但是上皮标记物的总体表达还是明显地保持下来。其次，研究者没有检测到经典EMT TF，ZEB1 / 2，TWIST1 / 2和SNAIL1的表达。只有SNAIL2被检测到（在70％的HNSCC细胞中），尽管其表达与肿瘤的程序相关，但与肿瘤内个体细胞的程序并不相关。最近的研究表明SNAIL2比其他EMT TFs早。 SNAIL2也涉及伤口愈合中的p-EMT应答。研究者注意到，EMT越来越被认为是一个连续和变化的过程。因此，研究者建议这里确定的体内程序反映了一个EMT的部分状态或p-EMT。几个额外的分析表明，这个p-EMT程序不同于源自细胞系和肿瘤模型的完整EMT程序，以及源自肿瘤的肿瘤谱间充质特征。

体外p-EMT细胞是动态的和侵入性的

研究者研究了5个HNSCC细胞系中p-EMT程序的功能意义。501个细胞的表达谱与人类肿瘤大不相同。然而，SCC9细胞的一个子集（口腔来源的细胞系）中的一部分包含了体内p-EMT程序。当通过流式细胞术分离这些高p-EMT细胞时，它们呈现出增强的侵袭性。它们的增殖速率也降低，与患者样本的scRNA-seq分析及之前的EMT研究一致。

先前的研究表明EMT的早期阶段可能是过渡性的或亚稳态的。因此，研究者猜想更多上皮细胞亚群中，p-EMT是否可以在动态平衡中，反映出瞬态状态。为了测试这个，研究者将来自SCC9的高p-EMT和低p-EMT细胞分类，培养它们，并重新评估标记物表达。两个群体在分选后4和24小时仍保持不同（t检验，p <>

 p-EMT细胞定位于靠近CAF的前沿

综上所述，研究者的体内图谱和体外功能数据表明，p-EMT程序是动态的，侵入性的，并且可能对TME提示有响应。这导致研究者进一步探究HNSCC肿瘤内表达该程序的细胞的原位空间定位。研究者使用免疫组织化学染色在p-EMT程序（PDPN，LAMC2，LAMB3，MMP10，TGFBI和ITGA5）中的顶部基因的肿瘤集合，以及HNSCC标记物p63。这些实验揭示了一组恶性细胞共同染色的p-EMT标记物，并定位到与周围基质紧密贴合的肿瘤的前缘。缺乏每个scRNA-seq的p-EMT程序的肿瘤不染色这些标记物。相反，上皮分化标志物（SPRR1B，CLDN4）在肿瘤的核心染色了一组不同的细胞，这与scRNA-seq数据中这些程序之间的负相关性一致。

图4  p-EMT细胞定位于靠近CAF的前沿

将p-EMT程序定位于前沿促使研究者考虑其与TME的相互作用，如配体受体信号传导。研究者推测基于一种细胞类型的配体和另一种细胞类型的相应受体的表达推定的肿瘤-基质相互作用。这个预测的“外向”信号以相似的比例从恶性细胞向各种TME细胞类型发出信号。相反，当研究者考虑对恶性细胞“传入”信号时，研究者发现CAFs表达显著更高数量的对应于受恶性细胞表达的受体的配体（超几何测试，p <>

为了评估配体-受体相互作用的功能意义，研究者用TGF-b处理SCC9细胞。暴露4小时诱导了类似p-EMT的程序，其在抑制TGF-β时被抑制（t检验，p <10-16;）。 tgf-b处理也增加了侵袭性并减少了增殖，而抑制作用具有相反的效果（anova，p=""><0.0001）。此外，tgfbi（tgf-β的已知靶标）和顶级p-emt基因的过度表达导致对侵袭和增殖的相似作用（t检验，p><0.005和anova，p><0.0001）。相反，tgfbi的遗传失活消除了tgf-β应答（anova，p><>

 肿瘤内HNSCC异质性在局部转移中的研究进展

为了进一步了解潜在的HNSCC扩散的决定因素，研究者将LN转移与原发性肿瘤进行了比较。尽管WES和推测的CNV显示了原发性和匹配的LN样本之间的存在一些基因组差异，但是可能是由于所研究的个体数量较少，他们没有鉴别出任何一致的区别。

图5  肿瘤内HNSCC异质性在局部转移中的研究进展

LN中恶性细胞的表达谱也与相应的原发肿瘤大致匹配。在每个配对样本中，都有较少的差异表达基因是显著差异的，但是它们在整个群体（cohort）中不一致。尽管在不同部位的p-EMT高低亚群发生率不同，但所有患者的原发肿瘤和淋巴结转移中p-EMT高低亚群的存在是一致的。这些发现提升了LN转移所需的程序是动态的可能性，解释了在原发性肿瘤和LN的比较中未被发现的可能原因。实际上，之前的研究也未能检测到肿瘤和局部转移灶之间的基因层面或转录层面的区别。

研究者还观察到淋巴结和原发性肿瘤间质和免疫细胞的特征和表现的总体一致性，虽然有一些重要的区别。大多数簇含有来自两个位点的细胞，但仅在原发性肿瘤中观察到了肌细胞，并且仅在LN中发现了B /浆细胞。成纤维细胞亚型也不同地表示：LN成纤维细胞富含肌成纤维细胞和CAF1亚型（超几何检验; p <>

这些发现促使研究者使用上述标记物检查LN标本的组织学形态。研究者发现大部分完整的上皮结构或恶性细胞的“巢”，在其外围具有p-EMT标记，被CAF和其他TME组分包围。这些观察结果与“集体迁移”模型一致，恶性细胞和基质细胞以团簇形式移动，淋巴源性扩散并形成LN转移灶。或者，单个细胞可能在团簇移动的同一部位播散和植入（“单细胞播散”），从而在LN转移瘤内重现原发肿瘤的异质性。

通过大量表达数据去卷积改良的HNSCC亚型分型

研究者接下来考虑了从scRNA-seq数据鉴定的恶性和间质表达程序的一般性和预后意义。最近的TCGA研究分析了数百个HNSCC肿瘤的表达谱，并将它们分为四个亚型：基础型，间充质型，经典型和非典型型。尽管TCGA分型是从大量肿瘤细胞中获取的，但研究者推断单个细胞组分的表达程序可能使研究者能够提取更多的了解。具体而言，研究者从这些批量数据中定义的分子亚型判断是否能够反映恶性程序，恶性细胞组成和/或TME组成的差异。

图6  通过大量表达数据去卷积改良的HNSCC亚型分型

研究者首先确定了十个HNSCC肿瘤的TCGA表达亚型。研究者评估了每个肿瘤的恶性细胞与其亚型表达特征的对应关系。引人注目的是，每个肿瘤清楚地映射到三个亚型之一：基本型（n = 7），经典型（n = 2），或非典型（n = 1）。没有一个恶性细胞映射到间充质亚型，即使它是口腔肿瘤中第二常见的亚型。然而，当研究者增大分析样本数目，当样本中包括基质和免疫细胞时，发现数百CAFs、肌成纤维细胞和肌细胞映射到间充质亚型。这一发现提出了一种可能性，即TCGA间充质亚型反映大批量样品中的高基质表现而不是独特的恶性细胞程序。实际上，TCGA样品的分析鉴定到间充质亚型肿瘤高度表达对CAF和肌细胞特异性的基因。此外，当研究者检查TCGA的HNSCC肿瘤的组织学切片时，鉴定到间充质肿瘤的成纤维细胞比基础型肿瘤多大约2.7倍（t检验，p <>

为了进一步研究TME组分对TCGA分类的影响，研究者设计了计算方法从TCGA分布中减去非恶性细胞的影响。研究者限制对恶性细胞表达的基因的分析。由于这些基因大多数也是由非恶性细胞表达的，研究者将它们的表达归一化以消除非恶性细胞的预期贡献。为此，研究者使用细胞类型特异性基因标签来估计每种肿瘤中每种细胞类型的相对丰度，然后，对于每种基因，研究者推断其在肿瘤中的大量表达与相对丰度之间的线性关系每个细胞类型使用多重线性回归。通过使用此回归模型的残差，消除了细胞类型频率（包括恶性细胞频率（即纯度））的影响，并且推断了每种TCGA肿瘤的恶性细胞特异性内在表达谱。

值得注意的是，虽然TCGA数据的标准分析恢复了所有四个亚型，推断的恶性细胞特异性表达的分析消除了间充质亚型，同时维持其他三个亚型。先前被归类为间充质的肿瘤被发现是先前描述的基底亚型（现称为“恶性基底”）的一部分。研究者验证了TCGA间充质评分反映了主要由CAF表达的基因，并且不与恶性细胞特异性p-EMT程序相关。因此，研究者建议可以将HNSCC肿瘤细化为恶性细胞的三种亚型（恶性基底，典型和非典型），前述间充质亚型反映具有较大基质成分的恶性-基底肿瘤。合并的恶性-基础亚型特别普遍，在TCGA中口腔肿瘤的占比> 70％，与研究者队列中十个肿瘤中的七个的分类一致。

p-EMT预测转移和不良病理学特征

纳入TCGA数据使研究者有机会在更大的队列中研究p-EMT程序的普遍性和重要性。在研究较小的样本群体中，p-EMT程序在来自10个肿瘤中的7个的细胞中明显，这与7个映射到恶性基底亚型的肿瘤完全对应。与研究者较小的队列一致，TCGA中恶性基底肿瘤中的p-EMT水平最高。此外，恶性基底TCGA肿瘤（而非非典型和经典肿瘤）的主成分分析显示前两个成分与p-EMT基因的表达相关，并与上皮分化基因呈负相关。值得注意的是，从大量表达数据的这些无偏分析定义的p-EMT程序与研究者的scRNA-seq分析所定义的高度一致。他们独立证实了除了SNAIL2之外的经典EMT TFs的缺失，并进一步支持人肿瘤中的体内p-EMT状态。因此，通过控制TME组成的混杂效应，研究者证明p-EMT程序表达的差异是HNSCC肿瘤中肿瘤间变异性的主要来源。

图7  p-EMT预测转移和不良病理学特征

HNSCC肿瘤的淋巴源性扩散形成LN转移是疾病负担和死亡率的主要来源。因此，口腔肿瘤的切除通常伴随着颈部剥离，以除去第一群体排出LN，这是一种与患者发病相关的手术。具有不良预后特征的肿瘤，例如囊外延伸或淋巴血管浸润，也需接受辅助治疗。因此，研究者测试了体内p-EMT标记是否可以预测恶性基底肿瘤中不利的病理学特征或疾病结果。

研究者发现，高p-EMT评分与LN转移的存在和数量以及更高的淋巴结分期有关（超几何检验; p <0.05）。研究者还发现肿瘤分级较高的关联，为低分化肿瘤的侵袭性提供解释。高p-emt评分与不良病理学特征（包括囊外延伸和淋巴管浸润）类似地相关，但缺乏可靠的生物标志物。有趣的是，p-emt与原发肿瘤大小无关，提示与侵袭和转移直接相关，而与肿瘤生长无关。总体而言，p-emt基因是具有这些临床特征的最高相关基因之一，而诸如细胞周期或缺氧的其他程序几乎没有强相关性。相反，上皮分化程序与转移呈负相关，与研究者之前观察到的p-emt与上皮分化之间的逆相关性一致。重要的是，p-emt计划比tcga间叶计划或常规emt特征更能预测淋巴结转移和局部浸润，这两者主要反映caf的发生频率。目前的临床实践依赖于不完美的淋巴结转移的预测因素，如肿瘤的厚度和大小，导致不必要的颈淋巴切除率很高（> 80％）。 p-EMT评分有助于预测淋巴结转移，从而降低不必要的颈淋巴切除相关的患者发病率。

讨论

肿瘤内异质性是肿瘤学的主要挑战。在新兴的技术中，scRNA-seq有助于确定与肿瘤生物学，诊断和治疗有关的发育等级，抗药性程序和免疫渗透模式。在这里，研究者应用这种方法来表征原发性HNSCC肿瘤和匹配的LN转移瘤。研究者的分析突出了一个复杂的细胞生态系统与恶性和非恶性细胞之间的积极串扰和与转移相关的体内p-EMT程序。研究者的研究代表了了解包括大多数实体恶性肿瘤在内的上皮肿瘤中肿瘤内表达异质性的重要步骤。研究者的主要发现是在体内恶性细胞中鉴定p-EMT程序。该程序涉及某些间质基因的上调和上皮程序的调节。尽管让人想起类似EMT的过程，但是该程序缺乏被认为驱动EMT的经典TF，除了SNAIL2之外。 SNAIL2水平与肿瘤个体细胞中的p-EMT程序不相关，但与研究者的小群组和TCGA肿瘤中的跨肿瘤的p-EMT程序相关，这暗示了转录后调节。先前的研究已经将SNAIL2与伤口愈合所需的类EMT变化联系起来，提高了这种生理反应被浸润性肿瘤细胞选择的可能性。

鉴于经典的调控程序的缺乏，上皮标记物的保留以及这种表达状态可能的短暂性，研究者推测p-EMT程序代表了可转移状态，虽然该状态和EMT的某些方面有一定的相似性，但在实际上却是和EMT不尽相同。尽管研究者描述了一个孤立的类似EMT的程序，EMT的分子描述目前正在重新评估，越来越多的证据表明是一个连续的状态。也假设一个动态的p-EMT状态被赋予侵入性而不丧失肿瘤起始能力。目前尚不清楚在HNSCC中是否存在完整的EMT状态，或者频谱是否只扩展到p-EMT。无论如何，研究者对患者的体内p-EMT样程序的定义应该指导这一过程的未来研究，因为它涉及人类癌症和转移。

几个观察结果表明，p-EMT程序可能会促进局部浸润和LN转移。首先，IHC分析清楚地表明该方案定位于原发性肿瘤的前沿，潜在地使细胞群体的集体移动成为可能。有趣的是，p-EMT细胞与周围TME中的CAF紧密接近，这与配体受体分析支持这些群体之间的调控性交叉对话相一致。其次，高p-EMT HNSCC细胞体外侵袭性增加。第三，数百个HNSCC肿瘤的大规模表达谱的解卷积将p-EMT程序确定为强烈预测淋巴结转移、淋巴血管浸润和结外延伸的患者之间变异的主要来源。重要的是，尽管CAF丰度并不独立预测淋巴结转移和浸润，但CAF评分高和p-EMT评分高的肿瘤转移倾向特别高，符合协同效应。这可能反映CAF和恶性细胞促进淋巴结疾病之间旁分泌信号的作用。

与此同时，其他的观察也调节了研究者的结论。首先，研究者研究的一个重要的警告是只有十个肿瘤被深刻地表征。对更多肿瘤的进行分析可能揭示额外的基质，免疫和恶性细胞状态，可能包括进一步向间充质状态进展的恶性细胞。其次，经典和非典型HNSCC肿瘤基本上没有p-EMT计划，但是它们的转移速度相似。因此，p-EMT可能与某些亚型相关，但与其他亚型相关，可能解释EMT在肿瘤生物学中的重要性。第三，尽管研究者的数据表明p-EMT状态对CAF信号有反应，但程序可能仅仅是由于肿瘤边界被破坏而增加TME相互作用的功能，因此是相关但不是转移的原因。需要进一步的研究来定义p-EMT和相应的基质相互作用驱动HNSCC转移的确切机制。

亚型分类方案已被应用于几种肿瘤类型的“大宗”分析，不能有效地解析瘤内异质性。在这里，对HNSCC肿瘤中恶性，间质和免疫细胞类型的表达状态的了解使研究者能够解卷积TCGA数据并推断恶性细胞特异性表达谱。该分析提示间充质亚型反映了TME，即肿瘤内CAF和肌细胞的分数。事实上，没有恶性细胞被映射到TCGA描述的间充质亚型。因此，间充质亚型可能反映基质组成，应在未来的研究中重新评估。相比之下，研究者发现对其他三种HNSCC亚型（经典，非典型，基础）的强有力的支持。来自研究者每个肿瘤的恶性细胞专门映射到这些亚型之一。控制TME时，这些亚型也保持稳定。尽管如此，基质组分提供正向预后的洞察力的潜力表明未来的分类系统可能最终需要将恶性和非恶性组分整合到肿瘤中。

总之，研究者的工作为HNSCC生物学特性和恶性细胞、基质细胞和免疫细胞图谱提供重要见解，并推断这些细胞应该与其他上皮恶性肿瘤相关。研究者从大量细胞混合的表达数据中推断恶性细胞特异性特征的计算方法，改进了HNSCC亚型分型，并提供了可以从许多其他癌症数据集提取信息的一般策略。最后，研究者对p-EMT程序的定义有助于将大量EMT数据与人类肿瘤的体内生物学相关联。虽然需要进一步的研究，但是这种p-EMT程序与不利的临床特征的关联可以指导未来的诊断策略和治疗方法。

参考文献：

[1] Sidharth V.Puram,ItayTirosh, et al. Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer[J]. Cell, 2017,171(7): 1611-1624.