答疑系列之二：外泌体测序及分析常见问题

生物_医药_科研 2018-12-17

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未来一周气温短暂回升，

起床难、穿衣难、出行难这都不是问题了！

是时候帮你解决一下课题难的问题了，

继上期转录组测序及分析常见问题答疑系列之后，

今天我们来看看外泌体研究中的注意事项。

样本篇

Q1：外泌体测序对RNA样品量有什么要求吗？

A1: 外泌体测序针对不同的测序项目有不同的要求，具体如下：

外泌体测序类型	RNA总量	RNA质量
sRNA测序	>20ng	浓度 1ng/uL，2100检测在25-200nt长度范围有峰
LncRNA测序	>30ng
全转录组测序	>50ng

Q1：外泌体测序对生物样品有什么要求吗？

A1: 根据多年的外泌体项目经验，发现不同类型的生物样本，所需要生物样本的体积差别很大，具体要求如下：

样本类型	体积	备注
血清/血浆	2-4mL	一般情况下，患者体液中外泌体的数量多于正常人
尿液	50-80mL
乳汁	10-20mL
脑脊液	5-10mL
细胞培养液	50-200mL	不同细胞系，分泌外泌体的能力不同

注：

1）奥维森也可以提供外泌体富集服务，血清/血浆/乳汁/脑脊液优先采用试剂盒法，尿液和细胞培养液优先采取超速离心法；

2）对于血小板外泌体、组织中外泌体等特殊样本，需要客户自己富集外泌体。

Q1：客户做外泌体研究时，一般用血浆还是血清？

A1: 血清是血液凝固之后的上层液体，所以其中少了纤维蛋白原，凝血因子，多了很多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体，有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。

血浆=血液-血细胞

血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子

所以一般实验选择血浆，在特殊情况下，如研究与血小板相关的疾病的时候，当然是血清更适合。

福利：奥维森团队制作了《外泌体采样方案》，详细讲解各种样本的采样方法和送样标准，感兴趣的小伙伴可以留下邮箱，小编私发给你哦！

测序分析篇

Q1：外泌体sRNA测序，采取什么策略？

A1: 外泌体RNA特点，含量低（1-8ng/mL 血浆），片段短（25-200nt），以small RNA为主，含有少量rRNA /lncRNA/circRNA。我公司外泌体sRNA测序采用NEB Mulpitlex small RNA library kit建库试剂盒，测序长度SE50，数据量10M或20M。

Q1：外泌体LncRNA测序，采取什么策略？

A1: 我公司外泌体LncRNA测序采用Nugen Ovation^® Solo RNA kit建库试剂盒，测序长度PE150，数据量12G。

Q1：外泌体sRNA测序分析都包括哪些项？

A1: 外泌体sRNA测序分析与普通sRNA测序分析是一样的，都有已知miRNA鉴定，新miRNA预测，已知/新miRNA家族分析、碱基编辑分析、表达和差异分析、靶基因预测和差异miRNA靶基因功能富集分析。

Q1：外泌体sRNA/LncRNA测序分析有什么优势？

A1: 外泌体sRNA/LncRNA测序分析采用文献通用数据库和软件，如果老师有指定的软件和数据库，可以变更；针对同时研究血液（或其他生物样本）和血液（或其他生物样本）外泌体中sRNA/LncRNA的项目，除了标准分析，奥维森分析团队会协助老师挖掘血液和血液外泌体中sRNA/LncRNA的共性和特性。

验证篇

Q1：在做外泌体QPCR验证实验时，需要多少血浆呢？

A1: 血浆采用试剂盒提取法富集外泌体，1-2mL的血浆足够后续的QPCR检测。

Q1：用外泌体提取试剂盒从2mL血清/血浆提取出来的外泌体有多少？能满足后续的电镜和WB吗？BCA方法测定的蛋白浓度是多少？

A1: 2mL血清/血浆提取出来的外泌体数量约1*10⁸—1*10⁹，可以满足电镜和WB实验，BCA方法测定的蛋白浓度为2-4ug/uL。

Q1：外泌体蛋白做WB用哪个marker好？

A1: 最常用的是CD63/CD81/CD9/HSP70等等，具体可以参考2016年thery^[1]发表的综述文章，在文末有专门介绍囊泡各个marker的使用。

Q1：外泌体蛋白做WB用什么内参基因？

A1: 外泌体做WB的内参基因一直存在争议。按照David Lyden^[2]发表于Nat Cell Biol的文章，actin和GAPDH 都可以作为内参。

参考文献：

[1] Joanna Kowal, Guillaume Arras, Marina Colombo, et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes[J]. PNAS Plus. 2016;113(8):E968-77. doi: 10.1073/pnas.1521230113. Epub 2016 Feb 8.

[2] Zhang H, Freitas D, Kim HS, et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation [J]. Nat Cell Biol. 2018 ;20(3):332-343. doi: 10.1038/s41556-018-0040-4. Epub 2018 Feb 19.

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