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2019年已有129项外泌体相关article发表 高分文章不少 外泌体的藏身之处正所谓高手在民间，欲一睹高人风采，就必先找到高人隐身之处。通常外泌体藏身于细胞上清、血液、尿液、脑脊液和其他体液。 血液 血液离心后有两种形式：血清和血浆，但不少小伙伴对它们傻傻分不清楚。前者是不经抗凝处理的血液会自动在一系列凝血因子的作用下发生凝集，离心后的上层液体；后者是经抗凝剂处理后，离心出去血细胞所得液体。两者虽然一母同胞，但显然血浆比血清更有内涵，其包含一些纤维蛋白原以及大量的外泌体，因而血浆也更受广大研究者的青睐。（所以大家都知道血清和血浆的区别了吧？）。 Tips: 1）血样抗凝剂花样繁多，科研汪们一不小心就会跌的鼻青脸肿。 肝素除了会抑制PCR外，还可与外泌体结合阻止细胞摄取外泌体；双嘧达莫（CTAD）则会阻止血小板的激活并抑制其释放外泌体；EDTA可能会干扰PCR反应（尽管其程度小于肝素），但是还是优于其他选择。 2）抽血时动作要轻柔迅速，并记录准确的抽血时间。 因为外泌体在抽血后30分钟内是稳定的，时间过长血小板会因种种物理因素而被激活并释放外泌体，导致外泌体数量增加。尿液中的外泌体性质稳定且RNA含量高于尿液中的细胞内的RNA。而收集尿液时，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液，并注意避免细菌污染。受试者的亲属（性别相同、年龄相仿）可作为对照。同时也要注意对饮食的控制。 脑脊液中的外泌体含量虽然较其他体液如血液少，但可作为神经系统疾病的潜在生物标志物。注意：采集脑脊液时避免受到血液污染，一般由于健康对照脑脊液获取困难，往往以其他神经异常的患者为对照。 外泌体的通缉之法 既然已经找到了外泌体的藏身之处，接下来就是请高手出山了。正常情况下外泌体是有侠义之风的，默默无闻的传递信号分子，以激活下游信号通路，帮助其他细胞各司其职。比如树突状细胞源性的外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。然而一旦细胞变坏了，其分泌的外泌体也就成了恐怖份子，像肿瘤细胞分泌的外泌体小哥就作恶多端，在机体中掀起了一片腥风血雨，引得科研界中的各路人马纷纷亮出自家法宝对其进行缉拿通缉。 秘笈一：超速离心法 此秘笈普遍被科研者所接受，通常与蔗糖密度梯度结合，使相对低密度的外泌体漂浮起来。然而，此法比较耗时耗力，一般需要8-30h，一次仅能处理6个样品，且产率较低，不适用于如血浆和血清等粘性生物液体。然而却可以获得高纯度的外泌体，并且这种方法在过去10年里已经被很多实验室成功应用于外泌体的分离。 秘笈二：按照尺寸大小分离外泌体 BiooScientific的ExoMir试剂盒通过两步超滤法就成功分离纯化外泌体。第一个微型过滤器基本上能去除所有细胞、血小板和细胞碎片，第二个微型过滤器可用正压力来获取所有直径大于30nm的囊泡。该方法以HPLC（高效液相层析）为基础的方法有可能获得高纯度的外泌体，但是这个过程需要专用设备。 秘笈三：外泌体沉淀 聚乙二醇（PEGs）通常被用于病毒和其他小颗粒的沉淀。基于此，System Biosciences 提供的ExoQuick试剂在被加入体液中后，离心即可沉淀外泌体。同时，Life Technologies也开发了五种Total Exosome Isolation试剂，能使低溶解度的成分（如外泌体）析出，然后通过低速离心收集外泌体。 这个牌子的试剂不是一般的贵 秘笈四：基于亲和力获得外泌体 外泌体相关抗原的抗体（如抗CD63、CD9、Alix、CD81、CD82、annexin、EpCAM和Rab5抗体）可以用作分离外泌体的特异性标记，用包被此类物质的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，可达到外泌体吸附分离的目的。 该方法可保证外泌体形态的完整性，且特异性高、操作简单，但非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不利于下一步实验，且不适合大量样本。 秘笈五：qEV法 该方法是利用Size Exclusion Chromatography(SEC)的原理对外泌体进行分离纯化的分离柱，在不损伤外泌体活性的情况下，有效去除样品中杂质蛋白和脂类。 如此可获得高纯度的外泌体，且快速简单，成本低廉。适合于细胞上清、血液、尿液等体液的外泌体分离。一般建议与qNano测量法联合使用，qNano可利用“可控电阻脉冲传感技术”对外泌体的浓度和尺寸进行快速准确的测量，因此qEV+qNano被视为快速准确的分离和测定外泌体的最佳解决方案。 外泌体的分析研究 既然已经捕获了“做坏事”的外泌体，就该拷问它所携带的货物中哪些是与某种疾病息息相关的。一般而言，外泌体里含有蛋白质和非编码RNA。因而，其分析研究可分为以下几类。 首先要外泌体进行鉴定，通常研究者可用透射电镜观察外泌体的结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球型），再结合免疫标记就可清楚的分析特定指标在外泌体表达的部位。对外泌体验明正身之后，就可以在蛋白水平和核酸水平对其进行深入分析。 1.蛋白水平的分析 （1）SDS-PAGE：通过SDS-PAGE电泳可以分析得到的外泌体中蛋白的含量及种类。 （2）Western-Blot：通过Western-Blot可以检测外泌体中特定的蛋白表达情况。 （3）2-DE等蛋白组学分析：可以了解外泌体中不同蛋白的表达、数量情况 2.基因水平的分析 （1）Real-Time PCR：通过PCR可以分析需要研究的指标的表达量。 （2）转录组分析：通过测序或者芯片，分析Exosome不同基因的转录水平。 （3）miRNA ：通过测序或者芯片，检测与Exosome相关的miRNA的表达情况，研究特定的miRNA。 （4）lncRNA分析：通过测序或者芯片，检测与Exosome相关的lncRNA的表达情况，研究特定的lncRNA与Exosome共同调控某种疾病的关系。 Tips: 1）由于外泌体内含有大量小片段RNA，测序时会测到许多非miRNA的小片段RNA，造成有效数据不足。一般建议使用芯片的方法检测外泌体miRNA。 2）lncRNA表达丰度较低，在外泌体中丰度更低，对于低丰度基因，芯片测准确性远远大于测序。所以建议使用基因芯片的方法检测外泌体lncRNA。 3）为了获取漂亮的测序或芯片结果，外泌体的含量是关键。不同样本提取外泌体得率不同，根据经验：3ml以上的血浆血清可得到约30-50ng的RNA；30ml以上细胞上清可得到约70-100ng以上的RNA；其他类型的体液与其性质有关，建议都以30mL以上。 |
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外泌体在科研界以迅雷不及掩耳之势火了起来，国自然中标量那是翻着倍的蹭蹭往上涨。然而目前外泌体的研究仍处于初级阶段，首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法，其次对其他囊泡与外泌体的区别仍不能做出清楚的判断。
