【原】【LorMe周刊】LysMe蛋白通过抑制免疫调节菌根共生

作者：薛娇，南京农业大学硕士在读，主要研究铁载体与植物互作。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍LysMe蛋白通过抑制免疫调节菌根共生，原文于2023年发表在《PNAS》。

导 读

丛枝菌根真菌（AMF）与大多数陆地植物形成互惠互利的共生关系。前期研究发现，AMF能分泌含有细胞溶解素基序（LysM）的效应因子来降低植物免疫促进菌根共生，以帮助AMF成功定殖。然而，LysM在植物-微生物相互作用中的作用尚不清楚。在本文中，作者发现蒺藜苜蓿Medicago.Truncatula分泌植物LysM胞外蛋白（LysMe）来促进与AMF共生，植物分泌LysMe蛋白至丛枝周膜与真菌细胞壁之间的间隙，即植菌界面膜空间（PAS）中，并在AM共生的建立中发挥作用。研究发现，敲除LysMe基因显著降低AMF定殖水平，基因回补后植株的AMF定殖水平则恢复到野生型水平；LysMe可能通过结合几丁质和壳聚糖来削弱几丁质等物质触发的植物免疫反应，从而促进AMF定殖和共生形成。

结 果

1．三个MtLysMe基因在含有丛枝的根皮层细胞中强烈表达

接种AMF Rhizophagus.irregularis后，M.truncatula根中的三个LysMe基因MtLysMe1/2/3基因的表达急剧增加（图1）。MtLysMe1/2/3的诱导表达模式与RiEF1α（植物根系真菌丰度基因）和MtPT4（AM共生标志基因）一致（图1B），这也表明了mtLysMe1/2/3的诱导表达与AMF定殖的增加相关。为了研究MtLysMe1/2/3的空间表达特征，作者将三个基因相应的启动子进行扩增并与β-葡糖苷酶（GUS）报告基因融合。得到的DNA结构用农杆菌转化在M.truncatula根中表达，结果显示，在没有接种R.irregularis的根中没有检测到任何GUS活性（图1C、E和G），与细胞间菌丝相邻的丛枝的根皮层细胞中有强烈的GUS活性（图1D、F和H）。这也就表明这三个基因仅在AMF定殖的根中表达，其他没有AMF定殖的组织或根中没有表达。

图1. 三个MtLysMe基因在含有丛枝的皮质细胞中强烈表达

2．MtLysMe蛋白结构和进化分析

从50种植物物种中检索了 304个同源蛋白质序列，并使用MAFFT进行系统发育分析，发现植物LysMe蛋白可分为两个主要分支，其中一个在所有植物中都很常见，而另一个只发生在AMF寄主植物中，如Medicago、柑橘、水稻和番茄。其中，MtLysMe1/2/3是AM宿主植物独有的分支，进一步表明这些蛋白质在AM共生中的作用。

3．MtLysMe蛋白在丛枝前体空间的特异性定位

为了确定三个MtLysMe蛋白的亚细胞定位，将MtLysMe1/2/3基因中的编码序列与mCherry荧光蛋白融合，表达出MtLysMe1/2/3-mCherry融合蛋白，接种R.irregularis 5周后进行共聚焦成像。如图2所示，来自MtLysMe1/2/3-mCherry融合蛋白的荧光信号在丛枝主干（用黄色箭头表示）和分支（用白色箭头表示）周围的含丛枝的根皮层细胞中清晰可见，丛枝细胞或未感染的邻近细胞中周围没有检测到信号。

图2. MtLysMe蛋白在Medicago菌根根细胞中的亚细胞定位

4．敲除MtLysMe1/2减少了AMF定殖和丛枝数量

为了研究MtLysMe蛋白是否在AMF定殖中发挥作用，作者采用CRISPR/Cas9靶向敲除MtLysMe1/2/3基因，两周后在mtlysme1和mtlysme2突变体中接种R.irregularis孢子，评估5周内AMF的定殖情况。与野生型相比，mtlysme1突变体的根部丛枝菌根丰度明显降低，但是其定殖没有显著差异，mtlysme2突变体中的根部丛枝菌根丰度和定殖都显著降低（图3A,D,E,F）。与WT相比，两个突变体根部接种R.irregularis时，MtPT4和RiEF1α（AM标记基因）的转录水平显著降低。并且mtlysme2突变体的减少幅度大于mtlysme1突变体（图3C）。在突变体中将MtLysMe1/2回补后，AMF的丰度和定殖又恢复到野生型水平。综上所述，MtLysMe1/2在促进AM共生方面起非常重要的作用，且MtLysMe2的作用大于MtLysMe1。

作者又用CRISPR/Cas9靶向诱变敲除番茄中MtLysMe2的同源基因SlLysMe2，得到与上述一致结果，与WT植物相比，sllysme2突变体根中丛枝菌根的定殖和丰度也显著降低（图4A-D），表明SlLysMe2基因也有助于AM共生的建立。

图3. MtLysMe基因对建立Medicago的菌根共生关系不可缺少

图4. MtLysMe2同源基因SlLysMe2对于番茄菌根共生的建立是必不可少的

5．MtLysMe与几丁质结合有助于抑制植物ROS的产生和免疫报告基因表达

MtLysMe突变体中免疫报告基因的表达显示，MtLysMe2在促进AM共生中的作用可能通过减弱植物免疫反应来实现，而真菌几丁质分解产物（CO8）可以触发植物的免疫反应。因此，作者测试了MtLysMe重组蛋白的功能是否会干扰AMF定植过程中几丁质诱导的植物免疫反应。结果显示，用1 μM CO8和1μMMtLysMe蛋白共处理Medicago根并没有显著抑制CO8诱导的ROS产生，但当MtLysMe蛋白增加到5μM时，特别是在MtLysMe2的情况下，CO8诱导的ROS产生显著减少（图A和B）；并且在CO8浓度100 nM的条件下，随着MtLysMe蛋白的增加，MtLysMe蛋白对免疫报告基因的抑制也逐渐增强（图5E-G）。

由于壳四糖（CO4）是激活AM共生信号通路的关键因子，作者还研究了MtLysMe蛋白是否可以结合CO4并影响CO4触发的共生反应，结果发现MtLysMe蛋白应用在植物根部可以抑制壳八糖（CO8）诱导的活性氧自由基产生和免疫响应报告基因的表达，同时不影响壳四糖（CO4）诱导的共生响应。

图5. MtLysMe蛋白抑制CO8诱导的ROS产生和免疫报告基因表达

结 论

作者以柑橘为对象的研究发现，在植物与AMF共生时，AMF能分泌LysM效应因子来降低植物免疫以帮助丛枝菌根成功定殖，促进菌根共生。与此同时植物也可以分泌相同效应的LysM胞外蛋白（LysMe）。LysMe在菌根丛枝细胞中特定诱导表达，增加AMF在植物根系的定殖，降低植物免疫反应，促进植物与AMF共生。系统进化分析显示LysMe仅存在于柑橘、番茄、水稻、苜蓿等菌根寄主植物中，在拟南芥等不能形成菌根的植物中不能存在。该研究显示，植物和它们的AMF伙伴一样，进化出了一套“植物效应因子”，可通过调节自身免疫促进菌根共生的建立。

论文信息

原名：Plant lysin motif extracellular proteins are required for arbuscular mycorrhizal symbiosis

译名：LysMe蛋白通过抑制免疫调节菌根共生

期刊：PNAS

DOI：10.1073/pnas.2301884120

发表时间：2023.6

通讯作者：潘志勇教授

通讯作者单位：华中农业大学