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编译：Jonie、song，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读植物是暴露于非生物和生物胁迫的固着生物，为了避免遭受病原菌的侵害，植物本身进化出了有效的质膜定位模式识别受体（PRR），发挥着识别非自身分子的作用。研究人员认为除了非自身分子外，某些内源性元素如细胞壁片段和小肽被释放到胞外空间参与植物免疫，并引发免疫反应。由较大的蛋白质前体产生的小信号肽是协调各种植物过程如发展和免疫反应的重要组分。然而，涉及植物免疫的小信号肽仍不为人所知。研究者开发了一种新的方法，即通过转录组学和蛋白质组学结合以获取推定的前体SSP。鉴定236个SSP，未注释的52个，在未注释的SSP中发现了一种调节水稻免疫力的小信号肽前体，命名为免疫反应肽（IRP）。在水稻悬浮细胞中，IRP的表达由细菌肽聚糖和真菌几丁质诱导，其过量表达增强了耐药基因PAL1的表达，诱导了MAPK活化细胞的活化。而且几丁质处理后悬浮细胞培养基中的IRP蛋白水平显著上升。本研究成功构建了一个简单有效的方法来发掘在水稻免疫中发挥重要作用的SSP前体，并且确定了52个未注释的SSP，有助于进一步明确水稻的免疫力。此种方法也可用于识别其他植物功能的SSP。原名：Identification of endogenous small peptides involved in rice immunity through transcriptomics- and proteomics- based screening 译名：通过基于转录组和蛋白质组学的筛选鉴定参与水稻免疫的内源性小肽 期刊：Plant Biotechnology Journal IF：6.84 发表时间：2019年 通讯作者：Yoji Kawano、刘仁义 通讯作者单位：日本冈山大学植物科学与资源研究所、福建农林大学 DOI号：10.1111/pbi.13208
本文通过农杆菌介导的水稻愈合组织转化获得转基因植物，以引入携带IRP编码区的p2K1载体产生表达IRP的悬浮细胞。随后用稻瘟病菌感染植物，PAMP处理悬浮细胞。随后将两组成品进行RNA和蛋白提取，反转录部分总RNA并进行实时荧光定量分析，剩余的RNA进行RNA测序和聚类分析，以鉴定处理后的植物样品或悬浮细胞中差异表达的基因以及对SSP的转录谱分析。分离蛋白质消除非靶蛋白，并进行液相色谱-串联质谱连用技术分析，以确定SSP的前体。最后通过转录组和蛋白组联合分析鉴定SSP的蛋白质家族成员。通过RNA测序和qRT-PCR分析检测到一个未注释基因LOC_Os04g28390强烈表达，且在PGN处理1小时后增强。最后，命名并鉴定了参与水稻免疫的新型SSP家族成员IRP。1 通过转录组分析鉴定稻瘟菌诱导的SSP候选体及其诱导物几丁质为了鉴定小内源性肽在水稻免疫中的作用，研究者首先分别鉴定了水稻植物体和水稻悬浮细胞中毒性水稻真菌稻瘟病菌和真菌几丁质诱导的基因。接种后1，2和3天收集水稻植物体，并用几丁质处理后1，3，6和12小时收集的悬浮细胞进行RNA测序分析（图1）。在RNA测序之前，根据先前的报道作者对稻瘟病菌进行三种防御性基因几丁质酶1，PAL1和PBZ1的适当诱导验证（图S1）。分别在一个或多个时间点分别进行稻瘟病毒菌感染和几丁质处理（图2a），植物体中共1848个（上，1336；下，512）个基因和悬浮细胞中1722（上，1420；下，302）个基因鉴定为差异表达。在植物体和悬浮细胞系统中，上调基因的数量远远高于下调基因的数量。为了证明由真菌和几丁质处理诱导的基因，研究仅聚焦于在稻瘟病真菌个几丁质处理中表达增强的基因。在植物体中，在1dpi（875）和2dpi（852）观察到相似数量的上调基因，而在3 dpi时上调基因的数量减少约50％。在用几丁质处理的悬浮细胞中，在1hpt观察到约80％的上调基因（1,145），这意味着在悬浮细胞中发生更多同步的免疫应答（图2a）。比较植物体和悬浮细胞之间的上调基因，在两种样品中发现302个基因上调（图2b）。GO富集分析表明，这些常见基因富含29个GO项，包括属于生物过程的（如蛋白质磷酸化，对生物刺激，代谢过程，几丁质分解代谢过程的反应）和分子功能（如蛋白酪氨酸激酶）活性，蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性，ATP结合）。作者分别在植物体中获得了79个上调的SSP候选物，在悬浮细胞中获得了90个SSP候选物（图2c，2d）。在植物体中，分别在1，2和3dpi诱导编码SSP的57，45和28个基因。在悬浮细胞中，在1hpt鉴定出74％SSP。这些结果表明大多数SSPs是在真菌感染或几丁质处理后的早期诱导的。在两个来源中确定的SSP候选者中，只有18个是常见的（图2d）。转录编程在植物免疫中至关重要，并且证据表明转录因子促成了转录重编程。为了鉴定保守的顺式调节基序，使用多重EM基序提取（MEME）分别鉴定植物体和悬浮细胞中上调的SR基因的1000-bp上游区域内的保守基序。三种顺式调节基序GGAGGGAGTA，GCCGCCGTg / cG和Ct / gc / gCCCCg / tc / gC在植物体79个SSP基因的启动子中过量表达（图2e）。GCCGCC基序是GCC盒的核心序列，是APETELA2 /乙烯反应因子（AP2 / ERF）型转录因子的DNA结合位点之一。在几种植物物种中，乙烯诱导型致病相关基因（PR）的启动子区域中发现了GCC盒。此外，水稻ERF转录因子OsERF92特异性结合GCC盒序列并负调节稻瘟病菌对盐耐受性的抗性。作者在RNA测序结果中验证了由真菌诱导治处理的6种ERF转录因子。在悬浮细胞中，在上调的SSP基因的启动子中鉴定出三种顺式调节基序Cc / aTGCa / cGG，TTGACTTGTT和c / aTATATAt / aAC（图2f）。第二个顺式基序与W盒重叠，（T）（T）TGAC（c / t），它是由WRKY转录因子特异性结合的基序。WRKY转录因子参与多种植物过程，如萌发，衰老和对生物和非生物胁迫的反应。作者发现30种WRKY转录因子被真菌或几丁质处理后上调，包括WRKY28，WRKY45，WRKY70和WRKY77，已知它们在抗病性中发挥关键作用。为了研究SSP的转录概况，对在植物中使用RNA测序鉴定的79个SSP和在悬浮细胞中鉴定的90个SSP的log2-转化的倍数变化值（logFC）进行了层次聚类分析（原文图S2）。植物中的79个SSP被分为7个簇。簇2由在1和2dpi诱导的24个SSP组成。GO分析显示，簇2中的几个SSP通常位于细胞外区域，包括三个含有立方结构域的蛋白质，三个蛋白酶抑制剂/种子储存/ LTP家族蛋白质和一个奇异果甜蛋白。共有21个SSP属于第4组，其成员的表达在1 dpi时升高。GO分析表明，簇4中的许多SSP与应激反应有关，例如两种奇异果蛋白（原文图S2a）。这一特征与PR蛋白的特征一致。相反，簇7由在2和3dpi诱导的7个SSP组成，包括3个早期光诱导蛋白（ELIP）。它们是拟南芥ELIPs，AtELIP1和AtELIP2的同源物，是有助于对光氧化应激和光抑制的耐受性的主要光响应基因。然而，与AtELIP1和AtELIP2不同，作者鉴定的OsELIP蛋白具有N末端信号序列，并且似乎是分泌蛋白。在悬浮细胞中，获得六个SSP簇（图S2b）。第4组的GO分析显示，几个SSP位于细胞外区域，包括6个立方蛋白，以及许多其他的SSP，例如参与应激反应的引导者。尤其是观察到的诱导四种含有质体蓝素样结构域的蛋白质。植物花青素是蓝色铜蛋白，其结合单个铜原子，充当电子转运蛋白，并且对非生物胁迫有响应。
图S1. 在真菌感染或几丁质处理期间防御基因表达。 用几丁质（b）处理的水稻植株中几丁质酶1和PBZ1的表达以及用几丁质（b）处理的水稻悬浮细胞中PAL1和PBZ1的表达通过qRT-PCR定量。
图1. 鉴定SSP的策略 水稻植物被稻瘟病菌感染，并在接种后1,2和3天收集样品，水稻悬浮细胞用几丁质处理1,3,6和12小时。在样品收集之前，分离悬浮细胞和培养基，并使培养基通过阴离子交换柱。对蛋白质样品进行SDS-PAGE，并回收小于25kDa的蛋白质用于PAGE凝胶。将RNA测序（RNA-seq）和质谱（MS）结果组合以鉴定小于250aa且含有N末端信号肽序列的小分泌蛋白（SSP）。
图2. 通过转录组分析鉴定的SSP （a）植物和悬浮细胞中差异表达基因的数量（DEG）（> 2倍变化，FDR <0.05）。黄色和绿色条分别表示上调和下调基因。（b）维恩图，显示植物和悬浮细胞之间重叠的上调基因。（c）植物和悬浮细胞中上调的SSP基因的数量（> 2倍变化，FDR <0.05）。（d）维恩图，显示植物和悬浮细胞之间重叠的上调的SF基因。（e和f）在用稻瘟病菌（e）感染的水稻植物中诱导的上调的79个SSP基因的启动子区域中鉴定的顺式调节元件和用几丁质（f）处理的悬浮细胞中诱导的90个上调的SSP基因。
2 蛋白质组分析鉴定植物中受稻瘟病菌和几丁质攻毒的SSP作者还进行了蛋白质组分析以确定候选SSP。研究中，作者采用以下策略来提高在培养基中鉴定SSP的效率：1）在几丁质处理之前用新鲜培养基洗涤悬浮细胞以除去培养基中预先存在的分泌蛋白; 2）考虑到液体培养基中的蛋白质浓度低，我们用丙酮沉淀后使用阴离子交换柱浓缩液体培养基（图1，图S6）; 3）为了消除大尺寸非靶蛋白并提高鉴定小蛋白的效率，作者进行了SDS-PAGE并收集了含有小于25 kDa蛋白的凝胶部分，因为小肽的前体通常小于200 aa ; 4）两次凝胶内消化; 结合胰蛋白酶与Asp-N的单酶消化和双酶消化用于每个样品以增加蛋白质的覆盖率（图3e）。最后，作者计算在用稻瘟病真菌或几丁质处理的样品中特异性检测到的蛋白质。分别在植物、悬浮细胞和培养基中鉴定了1121,1423和1568种蛋白质。消除了冗余后，总共仍有3327种蛋白质（图3a）。除了通过单一胰蛋白酶消化鉴定的1820种蛋白质之外，通过双酶消化特别的发现了1507种蛋白质，表明用于MS分析的两种蛋白酶的组合显着增加了鉴定的蛋白质的数量（图3b）。对植物，悬浮细胞和培养基中鉴定的蛋白质的维恩图分析显示，只有18-29%的蛋白质在三个蛋白质组中的两个之间共享，所有样品中共有68种蛋白质（图3c），包括与防御反应相关的几种蛋白质，如PAL1和PR Bet VI家族蛋白。接下来，在转录组分析中作者参照相同的标准从蛋白质组样品中筛选出SSP (图1)。从蛋白质组的数据中，作者分别从植物体，悬浮细胞和培养基中获得49，42和54个SSP。在植物体中，分别在1，2和3dpi出鉴定了总共27，13和19个SSP（图3d和表S2）。在悬浮细胞和培养基中，鉴定的SSP数量在3htp时最高。韦恩图分析显示，在双酶消化的样品中24％的SSP被独特的鉴定（图3e）。只有4个SSP在植物、悬浮细胞和培养基中共有。大多数先前鉴定的信号肽经翻译后修饰，并且修饰对其生理活性是至关重要的。因此，在分析中作者认为有三种翻译后修饰，在质谱分析中酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸上的硫酸化，脯氨酸和蛋氨酸的氧化反应，以及羟脯氨酸阿拉伯糖基化。在质谱分析鉴定的114个SSP中，检测到54个具有翻译后修饰的SSP（表S3）。有趣的是，大多数肽具有多种修饰，意味着这些SSP候选体是翻译后修饰的最佳目标。
图S6 SDS-PAGE分析阴离子交换色谱和丙酮沉淀后培养基中的蛋白质
图3. 通过蛋白质组分析鉴定的SSP （a）用质谱分析方法鉴定了水稻稻瘟病菌和悬液细胞感染的植株和几丁质处理的培养基中蛋白质的数量。黄色和绿色线表示胰蛋白酶消化和用胰蛋白酶和Asp-N双酶消化的结果。（b）维恩图，显示通过胰蛋白酶消化和双酶消化鉴定的重叠蛋白的数量。（c）维恩图，显示从植物，悬浮细胞和培养基中鉴定的重叠蛋白的数量。（d）分别在植物，悬浮细胞和培养基中鉴定的SSP数量。蓝色和橙色条分别表示胰蛋白酶消化和用胰蛋白酶和Asp-N双酶消化的结果。（e）维恩图，显示通过胰蛋白酶消化和双酶消化鉴定的重叠SSP的数量。（f）维恩图，显示在植物，悬浮细胞和培养基中鉴定的重叠SSP的数量。
结合转录组和蛋白质组分析，获得了236个SSP：植物体117个，悬浮细胞130个，培养基中54个（图4a）。在所有三个来源中只有七个重叠的SSP。另一方面，分别使用三种不同材料通过转录组学和蛋白质组学分析收获总共151和114个SSP。在转录组学和蛋白质组学分析中仅鉴定出29种常见的SSP（图4b）。有趣的是，作者能够检测到两个已知SSP家族的成员：RALF和PSK（表1）。在实验条件下检测到了5种RALF。通过质谱分析在悬浮细胞中鉴定OsRALFL6（LOC_Os01g25540），并通过RNA测序在植物中发现OsRALFL26（LOC_Os10g41980）和OsRALFL31（LOC_Os12g38360）。通过质谱分析在培养基中检测到OsRALFL7（LOC_Os01g25560）和OsRALFL8（LOC_Os02g44940），这意味着它们在几丁质处理后从悬浮细胞分泌到培养基中。OsRALFL7和OsRALFL8的mRNA水平不仅由真菌几丁质诱导，而且还由细菌肽聚糖（PGN）处理诱导（图5a，5b），表明OsRALF参与水稻对真菌和细菌感染的反应。鉴定的另一个小分泌肽家族是PSK，其在C末端具有高度保守的五肽序列YIYTQ（图S4b）。PSK具有多种功能，例如促进细胞生长，有助于花粉管引导和植物免疫。通过RNA测序在植物样品中检测到OsPSK4（LOC_Os07g03200），并通过qRT-PCR测定进一步证实（图S4a）。OsPSK4还在其N-末端具有信号肽序列，RR基序，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的识别位点和保守的成熟肽序列（图S4b）。AtPSK4被丝氨酸蛋白酶AtSBT1.1切割，并且AtPSK4的切割形式从愈伤组织分泌到愈伤组织诱导培养基中。在悬浮细胞中通过几丁质和PGN处理诱导OsPSK4mRNA表达（图5a，5b）。总之，这些数据表明RALF和PSK均参与水稻免疫。236个鉴定的SSP候选物包含7个PR蛋白家族（表1）。PR蛋白在受感染的植物中是可诱导的防御相关蛋白，被分类为17个家族并在免疫中起重要作用。在杯蛋白/生殖蛋白家族中鉴定出22种蛋白质，其中9种在培养基中发现。杯蛋白/生殖蛋白包含两个PR蛋白家族，PR-15和PR-16。水稻染色体8含有主要数量性状的抗稻瘟病真菌的基因座之一，包括12个胚芽样基因（OsGLPs）簇。在实验条件下，作者检测到位于染色体8的相同区域的10个OsGLP基因的诱导。通过多重RNA抑制染色体8中的12个生殖样基因使得水稻植物对两种不同的真菌疾病更敏感，稻瘟病和纹枯病，表明我们的染色体8中的OsGLPs参与了抗病性。我们还鉴定了18种在体外膜间传递磷脂和脂肪酸的非特异性脂质转运蛋白(nsLTPs)。一些研究已经证明了在各种植物物种中nsLTPs的细胞外定位。植物nsLTP包含PR-14家族，并参与各种植物过程，包括有性繁殖，种子发育和发芽，以及对生物和非生物胁迫的抗性。此外，鉴定了7种奇异果甜蛋白样蛋白，其中3种在培养基中（表1）。植物奇异果甜蛋白家族被归类为PR-5，并且它似乎具有抗真菌活性。PR-5家族成员蛋白的过表达抑制植物病原真菌，核盘菌和灰葡萄孢拟南芥的生长，并提高葡萄的霜霉病抗性。我们还发现了几种蛋白酶抑制剂（PI）家族，如蛋白酶抑制剂/种子储存/ LTP家族蛋白，鲍曼-伯克型麸胰蛋白酶抑制剂（BBI）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。植物中的BBIs参与对昆虫和盐胁迫的抗性。此外，一些功能研究报道半胱氨酸PI对植物具有杀虫和抗真菌作用。
图S4. 水稻和拟南芥中OsPSK4的表达分析及PSKs的系统发育分析。（a）通过qRT-PCR定量感染稻瘟病菌的水稻植物中的OsPSK4表达。误差线表示标准误。根据双尾t检验，用星号（***，P <0.001）描绘感染植物和模拟对照之间的统计学显着差异。（b）PSK的蛋白质比对。预测的N末端信号序列在蓝色框中，RR图案在橙色框中，YIYTQ图案在绿色框中。蓝色箭头表示推定的切割位点。（c）水稻和拟南芥中PSK的系统发育树。
图4. SSP的蛋白质家族 （a）维恩图显示将RNA-seq与MS结果组合后在植物，悬浮细胞和培养基中鉴定的重叠SSP的数量。（b）维恩图，显示RNA-seq和MS鉴定的重叠SSP的数量。
图5. 由PAMP诱导的OsRALFL和OsPSK4的表达
为了鉴定参与水稻免疫的新型SSP家族，作者分析了52个未注释的SSP，并选择了20个在其他植物物种中具有同源物的SSP。然后，使用qRT-PCR检查了20个SSP是否通过的几丁质处理诱导。通过对几丁质处理的（1小时）样品进行的RNA测序和qRT-PCR分析检测到一个基因LOC_Os04g28390的强烈诱导（图6b）。类似地，还发现该基因的表达在PGN处理后1小时增强。作者命名为基因免疫反应肽（IRP）。它是水稻基因组中的单拷贝基因，编码66-aa蛋白。IRP同源物仅在禾本科中发现（图6a，图S5）。所有IRP都具有N末端信号序列和保守的C末端。作者测试了IRP是否有助于防御反应，并使用玉米泛素启动子产生IRP过表达的悬浮细胞系。有趣的是，IRP过表达增强了防御基因PAL1的表达而没有几丁质处理。几丁质处理后，进一步诱导PAL1和IRP自身的转录（图6c）。IRP的过表达诱导两种MAP激酶MPK3和MPK6的活化，表明IRP通过调节MAPK的活性调节水稻免疫（图6d）。为了确认IRP的分泌特性，进行了平行反应监测（PRM）检测，因为PRM分析可以生成具有高分辨率和高质量精度的完整MS / MS数据，并广泛用于定量靶蛋白/多肽。使用悬浮细胞系统，在培养基中检测到IRP的20-aa的区域肽GEGWLEDGIGMVVDMLGELK，发现在几丁质处理2小时后在培养基样品中检测到更大量的IRP蛋白，证明IRP蛋白在几丁质处理后被释放到细胞外空间（图6e）。
图6. IRP参与水稻免疫。（a）IRP及其同源物的蛋白质比对。预测的N末端信号序列在蓝色框中。（b）在用几丁质或PGN处理的悬浮细胞中诱导IRP表达。IRP的表达水平通过qRT-PCR定量。（c）IRP过表达对防御基因PAL1的影响。将过量表达IRP的水稻悬浮细胞用几丁质处理1小时。＃1和＃2是表达IRP的两个独立的转基因水稻悬浮细胞系。IRP和PAL1的表达水平通过qRT-PCR定量，具有四个独立的重复。（d）IRP的过表达诱导MAPK活化。使用抗磷酸-p44 / 42MAPK抗体在WT和IRP过表达株系＃1和＃2悬浮细胞中检测到MAPK活化。CBB，考马斯亮蓝。在四个独立实验中获得了类似的结果。（e）几丁质暴露后培养基中IRP的蛋白质丰度增加。使用IRP的20-aa肽GEGWLEDGIGMVVDMLGELK作为光谱以匹配使用平行反应监测（PRM）方法获得的肽的MS / MS谱。
在这项研究中，研究者建立了一个简单而有效的方法来鉴定与水稻免疫有关的内源性小信号肽。通过蛋白水解处理从较大的50-200aa多肽前体产生小信号肽。考虑到从植物中纯化成熟小信号肽的困难，作者尝试通过鉴定其推定的前体SSP来分离小信号肽，所述前体SSP使用N末端信号肽序列编码小于250个氨基酸的蛋白质（图1）。为了增加已鉴定SSP在这项研究中，研究者建立了一个简单而有效的方法来鉴定与水稻免疫有关的内源性小信号肽。通过蛋白水解处理从较大的50-200aa多肽前体产生小信号肽。考虑到从植物中纯化成熟小信号肽的困难，作者尝试通过鉴定其推定的前体SSP来分离小信号肽，所述前体SSP使用N末端信号肽序列编码小于250个氨基酸的蛋白质（图1）。为了增加已鉴定SSP的数量，作者使用了三种不同的来源：结合的转录组和蛋白质组分析的植物，悬浮细胞和培养基。显然，三种不同来源的组合极大地增强了SSP的覆盖率（图4a），仅有12.3％的SSP在转录组和蛋白质组分析中被鉴定（图4b）。结果表明，使用不同来源的综合分析和方法是鉴别SSP候选者的有效方法。本研究基于转录组学和蛋白质组学的筛选方法，筛选出236个SSP候选基因，其中包括已知的涉及植物免疫的19个蛋白家族。研究者鉴定了两个已知的肽家族，一种与新型肽的候选者IRP相同的RALF和PSK。一些研究表明，预处理的肽减缓了病原菌的生长。将这些肽应用于作物以获得病原体抗性可能是有用的。可能的是，一些小肽涉及植物中的多个过程和功能。例如，AtPep1前体的过表达，PROPEP1增强了对病原体和防御反应的抗病性，同时促进根和空中生长。AtPep3不仅有助于植物免疫，还有助于盐度胁迫耐受。此外，CLAVATA3/ EMBRYO-SURROUNDING REGION-RELATED 25（CLE25）通过长距离信号传导中的脱落酸控制气孔关闭。这些实例表明，除了免疫外，内源性小肽对各种进程（如发育，非生物和生物耐受性）具有多效性作用。因此，与其他过程一样，如发育和生物和非生物胁迫反应，研究IRP肽在植物免疫中的功能也很有意义。
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