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大多数癌症研究和治疗决策都是在整个人群层面进行的，研究的对象往往是细胞群体。标准治疗策略通常针对一个受体或通路，将癌症视为同质性疾病。然而长久以来我们忽略了这些细胞之间的异质性。“世界上没有两片完全相同的树叶”，每个细胞也都是独一无二的。肿瘤组织就是一个包含不同遗传和表型特征的异质细胞的集合，其中不同的细胞对肿瘤进展，转移和抗药性都存在着一定的差异。 肿瘤细胞的异质性，内在因素来自基因组不稳定性，导致生物标志物、表观遗传特征、缺氧状态、代谢状态、分化阶段、侵袭潜力和基因型上存在差异。外在因素来自瘤微环境的不同，如：存在不同类型的成纤维细胞、促癌和抗癌的免疫浸润、不同的血管和淋巴管密度以及不同的细胞外基质（ECM）所导致，不同的肿瘤微环境进一步引发肿瘤的异质性。 肿瘤内异质性的常见类型及其内外在调节因素 随着高通量测序技术的发展， 2013年单细胞测序技术（Single Cell Sequencing，SCS）应运而生，它的出现被Nature Method 杂志评选为年度技术。该技术能够在单细胞水平对肿瘤组织的基因组学、转录组学和表观基因组学进行全面、精准的研究。本文主要介绍单细胞测序流程，讨论肿瘤领域各大单细胞测序技术的优势和局限性，以及在肿瘤研究中的一些应用。 单细胞基因测序的基本流程：单细胞的分离 --- DNA/RNA的提取和扩增（全基因组扩增和全转录组扩增）--- 测序 --- 后续的分析和应用。 单细胞捕获一般有三种方式： 流式细胞术，激光捕获显微切割以及微流控技术。显微操作（micromanipulation）无疑是一项非常精确的技术，而且利用毛细管（microcapillary）可以直接吸取细胞内容物，但是这项操作也需要耗费大量人力。其实大多数方案只需制备细胞悬液即可，因此如何更好的优化肿瘤并解离以产生细胞悬液是关键考虑因素。细胞悬液需要在细胞类型比例和表达模式上完全代表完整肿瘤。而后采用流式细胞术或细胞分选器（cellsorter），根据细胞表面表达的特异性分子标志物对细胞进行分类富集操作。这种策略也被用来分离非常微量的循环肿瘤细胞。 现在有很多单细胞RNA测序操作流程可供选择，不过不管采用何种策略，首先都需要通过逆转录反应，利用RNA合成出cDNA。然后才会有所区别，比如有一些方法是对整个转录组进行测序，有一些方法只针对转录子的5'和3'端进行测序。不论采用何种方法，目的都只有一个，那就是捕获原始的RNA分子，然后均一的、准确地对其进行扩增。核酸的捕获效率主要受到逆转录反应的影响，不过我们可以使用更小的反应体系，选择更好的逆转录酶来进行改善。另外，采用模板转换技术（template switching）也能够保证被捕获的绝大部分转录子都是全长片段。减少反应循环数也能够改善核酸扩增反应，还可以借助“抑制PCR（suppression PCR）”技术减少引物扩增，或者将取自不同样品的cDNA（这些cDNA都是分别做好标记的）混合到一起，提高起始反应模板浓度，用体外转录技术进行线性扩增（linear amplification）。另外，还可以利用特有的分子识别序列（molecular identifier sequences）对每一个RNA分子进行标记，这样即便在经历了非均一的扩增之后，我们还是能够对原始的RNA分子数量进行绝对定量。 以下是多种单细胞转录组技术的主要特征，差别主要体现在文库类型、通量上。 单细胞转录组技术的特征、优势以及局限性 全基因组扩增（whole-genome amplification）的起始反应产物更少，只有一个DNA分子。这样在扩增反应时就难免出现不均一的问题，即可能在基因组中某些位点会扩增多次，而另外一些位点则无法扩增。解决这个问题最常用的办法就是多重置换扩增技术（multiple displacement amplification, MDA），即使用随机引物，让这些引物与基因组广泛结合，同时使用一种特定的聚合酶，这种聚合酶能够置换与它自身附着在同一模板上的DNA链片段，形成一种反复分支结构（iterative branching structure），扩增出大段的DNA。早期循环对整个扩增反应的均一性起到了决定性作用。有一种扩增技术采用了一种独特的引物，这样能够生成闭合环状的扩增子（amplicon），而且这种扩增产物不会再进一步复制，等于是在进行PCR扩增反应之前先进行几轮线性扩增反应。将反应按比例扩大，同时对反应情况进行实时监控都有助于改善基因组扩增成功率低的问题，另外减少扩增次数，准备更少模板的测序文库也是一个比较值得发展的方向。 单细胞基因组技术的特征、优势以及局限性 单细胞转录组和基因组研究已成为研究癌症机制的重要工具，更多技术正在适应以单细胞分辨率运作，以先前无法获得的方式探索疾病。目前这几种常见的表观遗传分析方法现在也可以在单细胞水平上进行，包括用于定义开放染色质区域的DNase-seq 和ATAC-seq，用于研究染色体接触的Hi-C，用于组蛋白位置定位的ChIP-seq，用亚硫酸氢盐测序（单细胞亚硫酸氢盐-seq）或无亚硫酸氢盐方法（单细胞CGI-seq）用于分析DNA甲基化的状态，而CLEVERseq 和scAba-seq分别通过5’-氟胞嘧啶测序和5’-羟甲基胞嘧啶测序用于分析DNA去甲基化活性。对同一细胞中多个调节水平下进行多尺度分析是目前快速发展的领域，这使人们可以更全面地了解恶性细胞如何产生特定表型，功能或行为。 目前存在用于分析基因组和转录组（G＆T-seq和DR-seq），表观基因组和转录组（scMT-seq，scTrio-seq和scNMT-seq）的组合方法，以及用于研究蛋白质组和转录组的技术都正在发展。 单细胞蛋白质组学是另一个最重要的领域，因为蛋白质表达是细胞的最终功能输出。尽管没有用于全蛋白质组水平分析的商业方法，但已经开发了用于单细胞中的高参数蛋白质分析的几种技术。飞行时间质谱（CyTOF）利用重金属偶联的抗体通过飞行时间电感耦合等离子体质谱法定量蛋白质表达，理论上可以在单个细胞中复用多达135个参数。通过索引（CODEX）平台进行的共检测还能够使用基于原位聚合的索引程序和荧光barcoded抗体进行高参数蛋白质表达分析，这个方法一大优点就是可以提供了天然组织环境中细胞群的空间定位。用于单细胞分析的空间基因组学技术，例如FISSEQ ，seqFISH 或MERFISH ，是另一个快速发展的领域，该技术揭示了特定于肿瘤微环境的细胞邻域。最终，空间方法将允许研究人员定义与特定组织学和病理组织表型相关的细胞群的变化。 亚克隆异质性的单细胞研究，可以帮助人们更好的认识亚克隆异质性，更清楚的了解它们在肿瘤进展期间进化的新细节。肿瘤的抗药性究竟是筛选出了预先存在的罕见克隆，还是通过诱导新突变获得性抗性？这个长期争论的话题，单细胞遗传分析提供了新的见解。新辅助化疗前后乳腺癌患者纵向样本的单细胞DNA测序就显示抗生素基因型预先存在并通过化疗被选择。CTC的单细胞分析也可以揭示耐药的遗传机制。 除了遗传异质性以外，单细胞技术还可以帮助分析肿瘤细胞中的细胞分化。ScRNA-seq研究表明，许多正常组织由成体干细胞库维持，成体干细胞分化为多种“细胞类型”，具有不同的“细胞状态”，区别在于细胞分化，活化，代谢状态或细胞周期阶段的细微差别。单细胞技术提供了测量单个细胞中细胞状态的机会，并可将肿瘤细胞映射到正常组织中所对应的细胞状态。 在肿瘤的发生过程中，转移是一种罕见的事件，其中大多数癌细胞并不能完成侵袭、内渗，外渗，播种和定植以产生恶性的巨大转移肿瘤。而单细胞基因组技术可以更好的助力癌细胞的转移。在下图显示的模型中，癌细胞在基因型（细胞核）和表型（细胞质）中是异质的，而且转移起始细胞两者兼具。虚线箭头表示微转移过程中的癌细胞可以死亡。微转移内的死亡率可以平衡增殖率，从而防止由于未能产生净阳性生长而发展为巨大转移。 单细胞水平的转移起始细胞的遗传和表型特征 参考资料 1. 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