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百创汇/报道 单细胞测序技术 概述 定义 单细胞测序（Single Cell Sequencing）就是获取单个细胞遗传信息的测序技术。主要解决以下6大问题： a. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度； b. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基化，以及组蛋白的各种修饰； c. RNA的序列：AUCG怎么排列，以及各序列的丰度； d. RNA的表观遗传修饰：比如近年很火的m6A修饰； e. 染色质的结构：3C、4C、5C等各种C； f. 其他应用：比如DNA损伤位置、蛋白-蛋白相互作用、细胞异质性、珍贵样本等。 发展历程  单细胞测序行业分析   ● 2018年4月份，10x Genomics公司筹集到1.25亿美元的资金，累计融资2.38亿美元，估值为9.25亿美元。17年年收入7000万美元，18年超过1.4亿美元。 ● 市场体量：2017年已达到20亿美元，2025年预期超过60亿美元。 单细胞测序技术原理 目前主要有两种策略来实现单细胞测序： a. 将单个细胞分离出来，并独立构建测序文库，最终进行测序的路线，但是将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。 b. 基于标签（barcode）的单细胞识别，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。 单细胞测序技术的流程主要包括单细胞分离、细胞溶解与基因组 DNA获取、全基因组扩增、测序与数据分析 4 个方面。 单细胞分离  细胞溶解与基因组 DNA获取  细胞溶解方法的选定，需要综合考虑多方面因素，如细胞的类型、下游用途、gDNA 纯化难易程度等。 物理法和化学法原理及操作相对简单，但是可能会造成 gDNA 的降解或gDNA 断裂。酶裂解法是最温和的方法，对于一些复杂的群落，通常联合使用多种酶来达到彻底溶解的目的。 全基因组扩增 全基因组扩增技术主要分为以下几种类型：
测序与数据分析 单细胞数据分析的基本流程与传统序列分析相似，数据分析前首先要移除接头序列( adapter) 、连接序列( linker) 、标签序列( barcodes) 、低质量碱基和污染 DNA。 行业龙头：10X Genomics  10X Genomics和Drop-Seq具有类似的技术原理。从横向孔道中逐一输入凝胶微珠，第一纵向孔道输入细胞，凝胶微珠与细胞碰撞后会吸附在凝胶微珠上，并通过微流控技术，将之输入到第二纵向孔道，即油相孔道中。这时候，就形成了一个个油滴，最终输出并收集在EP管中。每一个油滴中会落入一个细胞以及一个凝胶微珠，那么在每一个凝胶微珠中上长满了不同的Cell Barcode和UMI Barcode连接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，构成我们的捕获凝胶微珠。而这个凝胶微珠抓手就会使用oligo dT抓住mRNA构建文库。 10X的基本技术原理：一个油滴= 一个单细胞= 一个凝胶微珠= 一个RNA-Seq。 行业龙头：BD的Rhapsody平台  BD的技术可以追溯到2015年Single Cell Cytoseq技术，采用CytoSeq特有的蜂窝板技术。该技术用20W+的微孔（该数量级远大于Input细胞数量），保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了10X中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题，采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率，保证Input细胞的全面使用。对于Input细胞的量更少的情况，可以基于10E5的细胞总量开始进行前期处理以及后期捕获操作。而在细胞捕获完成后，进行细胞裂解后，同样的也进行细胞中RNA polyA序列的抓取工作。 BD的基本技术原理：一个微孔= 一个单细胞= 一个磁珠= 一个RNA-Seq。 单细胞测序的临床应用 a. CTC细胞测序：癌症的血液检测，通过对血液中的肿瘤细胞进行测序，找到突变位点，针对性能进行靶向药物治疗。 b. 肿瘤亚细胞群测序：肿瘤发生、发展过程中，细胞不断发生新的突变，型成许多亚细胞群，单细胞测序可以对这些亚细胞群进行分别的测序，并找到对应的治疗方案。 c. 免疫细胞测序：免疫细胞在对抗原发生识别后，免疫细胞的基因组发生重排，并产生对抗原特异的抗体。对免疫细胞的测序，可以找出特异的基因结构。 d. 体外受精的胚胎测序：在把胚胎植回母体之前，先取一个细胞进行测序，确认基因正常后再植回，以保证胚胎是正常的。 e. 无创产前检测：胎儿有核红细胞和滋养层细胞进行测序。 f. 临床微生物检测：利用从患者体内获取的极微量细菌，不经培养，利用单细胞测序的拓展技术直接进行感染的早期诊断和耐药（药敏）检测。  |
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