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李孝敏, 赵浩亮, 马鹏, 王晋喜, 郭修栋. lncRNA GAS5通过下调miR-223的表达提高结肠癌细胞的放射敏感性[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2018, 38(10): 734-740, DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2018.10.003.
lncRNA GAS5通过下调miR-223的表达提高结肠癌细胞的放射敏感性
1. 030000 太原, 山西大医院普外科;
2. 030000 太原, 山西大医院放疗科
收稿日期: 2018-05-22
[摘要]
目的
探究生长特异抑制物5（lncRNA growth arrest-specific 5，lncRNA GAS5）通过靶向调控miR-223的表达对结肠癌细胞的放射敏感性的影响。方法
采用荧光定量PCR（qPCR）检测多种结肠癌细胞系中lncRNA GAS5的表达量，选择表达量较低的作为后续研究对象；细胞克隆实验检测过表达lncRNA GAS5对结肠癌SW480细胞放射敏感性的影响；通过生物信息学数据库starBase以及双荧光素酶报告基因实验预测以及验证lncRNA GAS5的靶基因miR-223；qPCR检测miR-223在多种结肠癌细胞系中的表达量，以及过表达lncRNA GAS5对SW480细胞中miR-223表达量的影响。结果
与人正常结肠上皮细胞（NCM460）相比，lncRNA GAS5在结肠癌SW480、LOVO、HT-29、SW620细胞系中的表达量显著降低（t=15.25、8.69、14.42、11.62，P < 0.05），其中在SW480细胞中的表达量最低；过表达lncRNA GAS5或者下调miR-223显著降低细胞的存活分数（8 Gy时lncRNA GAS5：t=13.51，P < 0.05；anti-miR-223：t=14.93，P < 0.05），促进凋亡（lncRNA GAS5：t=8.30，P < 0.05；anti-miR-223：t=7.32，P < 0.05），增加结肠癌细胞放射敏感性；生物信息学分析显示，lncRNA GAS5 3'端序列中包含与miR-223的结合位点，过表达/下调lncRNA GAS5后，miR-223的表达量下降/上升。结论
lncRNA GAS5通过靶向调控miR-223的表达促进结肠癌细胞凋亡、抑制其存活，从而提高结肠癌细胞的放射敏感性。
[关键词]
长链非编码RNA
结肠癌
放射敏感性
GAS5
miR-223
lncRNA GAS5 enhances the radiosensitivity of colon cancer cells by down-regulating miR-223 expression
1. Department of General Surgery, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030000, China;
2. Department of Radiation Oncology, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030000, China
[Abstract]
Objective
To explore the effect of lncRNA of growth arrest-specific 5 (lncRNA GAS5) on the radiosensitivity of colon cancer cells by targeting miR-223.
Methods
The expressions of lncRNA GAS5 in a few of colon cancer cell lines were detected by real-time quantitative PCR (qPCR). The cell lines with low expression level of lncRNA GAS5 were selected for subsequent study. The effect of overexpression of lncRNA GAS5 on the radiosensitivity of colon cancer SW480 cells was detected by cell cloning experiments. The target gene miR-223 of lncRNA GAS5 was predicted and validated by the bioinformatics database starBase and dual luciferase reporter assays. qPCR was used to detect the expression of miR-223 in various colon cancer cell lines and the influence of lncRNA GAS5 overexpression on the expression of miR-223 in SW480 cells.
Results
Compared with normal human colonic epithelial cells (NCM460), the expressions of lncRNA GAS5 in the colon cancer SW480, LOVO, HT-29 and SW620 cell lines were significantly lower(t=15.25, 8.69, 14.42, 11.62, P < 0.05), with the lowest level in SW480 cells. Both overexpression of lncRNA GAS5 and down-regulation of miR-223 significantly increased the radiosensitivity of colon cancer cells by decreasing cell survival fraction(at 8 Gy, lncRNA GAS5, t=13.51, P < 0.05;anti-miR-223, t=14.93, P < 0.05)and promoting apoptosis(lncRNA GAS5, t=8.30, P < 0.05;anti-miR-223, t=7.32, P < 0.05). Bioinformatics analysis showed that the 3'sequence of lncRNA GAS5 contained the binding sites with miR-223. After overexpression or downregulation of lncRNA GAS5, the expression of miR-223 was enhanced or reduced.
Conclusions
The lncRNA GAS5 promotes the apoptosis of colon cancer cells and inhibits its survival by targeting miR-223 expression, thereby increases the radiosensitivity of colon cancer cells.
[Key words]
Long chain non-coding RNA
Colon cancer cells
Radiosensitivity
GAS5
miR-223
近年来，结肠癌的发病率和死亡率呈现上升的趋势[1-2]。越来越多的研究证实，长链非编码RNA(long chain non-coding RNA, lncRNA)参与组织的癌变、转移、细胞的增殖等过程，不同肿瘤组织中具有不同的转录因子，在肿瘤的发生、发展中扮演重要的调控角色[3-5]。长链非编码RNA生长特异抑制物5(lncRNA of growth arrest-specific 5, lncRNA GAS5)最初发现于肿瘤抑制基因cDNA消减文库，可作为肿瘤潜在的抑制基因。lncRNA GAS5在胚胎和机体成熟组织中广泛表达，但在结肠癌中的作用以及分子机制尚不十分清楚。本研究通过检测lncRNA GAS5在结肠癌细胞中的表达量以及调控结肠癌细胞放射敏感性，研究lncRNA GAS5在结肠癌中的生物学作用以及相关作用机制，为降低结肠癌细胞辐射抵抗、改善临床结肠癌放疗效果提供可靠的理论基础。 材料与方法1.实验试剂及仪器：结肠癌SW480、SW620、LOVO、HT-29细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所，DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、反转录试剂盒购自美国Thermo公司；胰蛋白酶、青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海碧云天生物技术研究所；姬姆萨染色液、甲醇购自美国Sigma公司；Lipofectamine 2000、TRIzol试剂购自北京天根生化科技有限公司；膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；碘化丙啶(PI)购自上海生工生物有限公司；双荧光素酶报告基因由上海翰宇生物科技有限公司合成；pRL-TK海肾萤光素酶报告基因载体购自美国Promega公司；pcDNA-GAS5、siRNA-GAS5、miR-223 mimics、anti-miR-223购自上海吉玛生物有限公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司，7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)购自美国ABI公司 2.细胞的培养：SW480、SW620、LOVO细胞培养于DMEM培养基中，HT-29培养于DMEM/F12培养基中，均加入10%胎牛血清和1%的青-链霉素，培养条件为37℃、5% CO2，显微镜下观察到细胞浓度达到80%左右，加入0.25%胰酶消化，采用完全培养基终止消化，1 000 r/min，离心半径10 cm, 离心2 min，弃去上清液，按照1 :3或1 :4的比例进行传代。 3.荧光定量PCR(qPCR)：收集5×105结肠癌细胞，PBS冲洗3次，加入1 ml TRIzol冰上裂解5 min，提取细胞中总RNA，超纯水溶解RNA，-80℃保存。吸取2 μg总RNA，加入12 μl超纯水，70℃孵育5 min，冷却后置于冰上，加入1 μl(200 μ/μl)反转录酶，42℃孵育60 min，70℃加热10 min，保存于-20℃。基因引物由上海生工生物有限公司合成，lncRNA GAS5引物上游序列为5′ AAGCCATT GGCACACAGGCATTAG 3′，下游序列为5′ AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA 3′；miR-223上游序列为5′ GGGGGTGTCAGTTTGTCAAAT 3′，下游序列为5′ CAGTGCAG GGTCCGAGGTAT 3′；GAPDH引物上游序列为5′ ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG 3′，下游序列为5′ TTTGCTTGAAGTTTCACTGGCATC 3′。反应条件为95℃ 2 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，35个循环。实验重复3次，2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。 4.细胞的转染:结肠癌细胞常规培养于DMEM培养基中，细胞融合度达到50%~80%将pcDNA-GAS5、siRNA-GAS5、miR-223 mimics、anti-miR-223以及相应的阴性对照转染入细胞。将培养基更换为Opti-MEM，加入250 μl Opti-MEM分别稀释RNA序列和Lipofectamine 2000，室温孵育5 min后，将二者充分混合，室温下孵育20 min，形成转染复合物；吸取生长培养基，每孔细胞中加入上述转染复合物，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养6 h，弃去转染液，更换为完全培养基继续培养。各转染片段序列如下所示：siRNA-GAS5: 5′ AGCTGGAAGTTGAAATGG 3′，5′ GTTCGGCTGAGAGGTATGG 3′；miR-223：5′ UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA 3′；anti-miR-223：5′ UGGGGUAUUUGACAAACUGACA 3′。 5.细胞克隆实验：取生长状态良好的细胞，根据不同的照射剂量(0、2、4、6、8 Gy)，源靶距(SSD) 100 cm，照射野10 cm×10 cm，剂量率5 Gy/min，射野覆盖全细胞培养板，接种不同浓度细胞至6孔板中，加入培养基至3 ml，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。显微镜下每2天观察1次，7 d左右出现肉眼可见的克隆团，即可终止培养，加入PBS清洗3次，甲醇固定20 min，姬姆萨染色40 min，自来水清洗数分钟，显微镜下计算有效克隆数(≥50细胞数)。细胞的克隆形成率=有效克隆数/接种细胞数×100%。 6.细胞凋亡实验：取生长状态良好的细胞，调整其浓度为1×106/ml，培养24 h后，弃去培养基，制成单细胞悬液，每孔加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混合均匀，避光静置10 min，流式细胞仪分析凋亡率。 7.靶基因的预测：使用生物信息学数据库starBase对靶基因进行预测，进行后续研究。 8.双荧光素酶报告基因法：将293T细胞接种于24孔板中，待细胞汇合度达到80%左右，将1 μg报告基因、50 ng内参pRL-TK共转染293T细胞，置于细胞培养箱中培养24 h，加入miR-223 mimics、anti-miR-223或者正常细胞对照转染细胞，24 h加入60 μl细胞裂解液，摇床中振荡20 min，加入底物，分析荧光素酶的活性。 9 统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行分析。结果以x±s表示。两组间数据的比较经正态性检验符合正态分布采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。 结果1. lncRNA GAS5在结直肠癌细胞内相对低表达：qPCR检测结果如图 1所示，与人正常结肠上皮细胞(NCM460)相比，lncRNA GAS5在结肠癌细胞系SW480、LOVO、HT-29、SW620中的表达量显著降低，差异有统计学意义(t=15.25、8.69、14.42、11.62，P < 0.05)，其中lncRNA GAS5在结肠癌SW480表达量最低，因此选取SW480细胞进行后续实验。
2.过表达lncRNA GAS5增强结直肠癌细胞放射敏感性：结果如图 2A所示，结肠癌SW480细胞转染后，经qPCR检测结果显示，与转染携带无意序列的pcDNA相比，lncRNA GAS5在转染携带目的序列pcDNA的细胞中表达量显著增加，差异有统计学意义(t=12.23，P < 0.05)；上调lncRNA GAS5在结肠癌SW480细胞中的表达量显著降低细胞的存活分数、促进凋亡，增加结肠癌细胞放疗敏感性(图 2B-F)，其中lncRNA GAS5放射增敏比为2.155(表 1)。
表 1(Table 1)
3. lncRNA GAS5与miR-223的靶向验证：经过starBase软件预测结果显示(图 3A)，lncRNA GAS5和miR-223之间有相似的结合位点，推测lncRNA GAS5可能对miR-223有一定的调控作用。双荧光素酶报告基因法检测结果显示(图 3B、C)，当上调miR-223表达量，野生型的lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性显著受到抑制(t=26.36，P < 0.05)，相比之下，突变型lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)；下调miR-223表达量时，野生型的lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性显著升高(t=15.09，P < 0.05)，突变型lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性仍无显著变化(P>0.05)。
4. anti-miR-223增强结直肠癌细胞放射敏感性：qPCR检测miR-223在结直肠癌各细胞系中的表达量，结果如图 4A 所示，与人正常结肠上皮细胞相比，miR-223在结肠癌SW480、LOVO、HT-29、SW620细胞系中的表达量显著增加，差异有统计学意义(t=10.35、7.56、7.67、6.76, P < 0.05)，其中在SW480细胞中的表达量显著最高；转染anti-miR-223载体进入SW480细胞，显著降低细胞中miR-223的表达量(图 4B)；下调miR-223的表达量显著抑制SW480细胞存活分数、促进凋亡，增加结肠癌细胞放疗敏感性(图 4C-G)，其中anti-miR-223放射增敏比为2.345(表 2)。
表 2(Table 2)
5. lncRNA GAS5调控miR-223的表达量：qPCR检测结果显示(图 5)，过表达lncRNA GAS5显著降低miR-223的表达量，与对照组相比，差异具有统计学意义(t=8.35，P < 0.05)；下调lncRNA GAS5的表达量促进SW480细胞中miR-223的表达量，与对照组相比，差异具有统计学意义(t=8.59，P < 0.05)。
讨论 研究发现，lncRNAs与多种肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡和发展过程密切相关，为肿瘤的临床治疗提供了新的研究方向[6-7]。lncRNA在肿瘤组织中的表达量异常，对肿瘤的发生、发展起着抑制或者促进作用[8-10]。研究证实，lncRNA MALAT1可靶向调控胰腺癌细胞中miR-204的表达水平从而影响细胞的恶性生物学特性，对胰腺癌的进展起重要调控作用[11]。在结肠癌中，lncRNAs可通过抑制或促进肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭等生物学特性参与结肠癌的进展。近年来的研究表明，lncRNAs与肿瘤的放射敏感性也具有显著相关性，如HOTAIR可显著抑制p21的表达量，从而降低宫颈癌HeLa细胞放射敏感性[12]。lncRNAs也可通过促进肿瘤细胞的凋亡率，从而增加放射敏感性，如lncRNA ANRIL显著促进鼻咽癌细胞的凋亡从而增加细胞的放射敏感性[13]，提示可通过研究lncRNAs的在肿瘤中的作用机制，提高细胞的放射敏感性，增强放射治疗的效果。 lncRNA GAS5含有630个碱基，参与机体许多生命活动。研究表明，在肿瘤的发生、发展过程中，lncRNA GAS5可作为一种肿瘤抑制因子发挥重要作用。研究证实，lncRNA GAS5在多种肿瘤组织中的表达量显著降低，如乳腺癌[14]、胃癌[15]、非小细胞肺癌[16]以及前列腺癌[17]，且与细胞的生长、凋亡密切相关。目前，lncRNA GAS5在结肠癌细胞的表达以及与细胞放射敏感性的相关研究较少。本研究通过qPCR实验检测lncRNA GAS5在多种结肠癌细胞系中的表达量，结果显示，与前人研究结果一致，lncRNA GAS5在结肠癌细胞系中的表达水平较正常结肠上皮细胞显著降低；过表达lncRNA GAS5显著抑制SW480细胞的存活分数，诱导细胞凋亡，增强SW480细胞的放射敏感性。 lncRNAs可通过多种途径参与肿瘤的发生、发展[18-19]。研究表明，miRNA可与lncRNAs相互作用从而发挥调控肿瘤细胞生物学行为、放射敏感性的作用，如miR-145的表达量与DNMT3具有负相关性，可通过负反馈影响前列腺癌细胞的放射敏感性[20]。众多研究表明，miR-223在结肠癌组织以及血清中的表达量异常，与结肠癌细胞的恶性生物学特性、肿瘤的转移以及预后密切相关[21-22]。为探明lncRNA GAS5在结肠癌中的相关作用机制，本研究通过starBase软件预测发现，lncRNA GAS5和miR-223之间部分碱基通过互补配对结合，推测lncRNA GAS5可能对miR-223有一定的调控作用；进一步通过双荧光素酶报告基因法检测发现，无论上调或下调miR-223的表达量，野生型的lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性均发生相应变化，而突变型的lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性均无明显变化，表明lncRNA GAS5可以结合miR-223的3′UTR处序列抑制其表达量；下调miR-223的表达量显著抑制SW480细胞的存活分数，诱导细胞凋亡，增强SW480细胞的放射敏感性，与过表达lncRNA GAS5结果相似；上调或下调lncRNA GAS5的表达显著调节SW480细胞中miR-223的表达量，表明miR-223和lncRNA GAS5形成一个负调控，并通过该负反馈通路调控结肠癌细胞的放射敏感性，以上均说明lncRNA GAS5可直接调控miR-223表达及活性影响结肠癌细胞的放射敏感性。 综上所述，本研究通过qPCR检测了lncRNA GAS5在结肠癌细胞系中的表达量以及对细胞放射敏感性的影响，结果发现lncRNA GAS5在多种结肠癌细胞系中的表达量下调，可能通过靶向作用与miR-223调控结肠癌细胞放射敏感性。但本研究只在体外探讨了lncRNA GAS5对结肠癌细胞放射敏感性的作用，并没有在体内进行验证，后续会在体内进行进一步探讨。 利益冲突 第一作者对全文负责，所有作者承诺实验、文章没有利益冲突作者贡献声明 李孝敏参与实验设计、数据整理、论文撰写；赵浩亮参与实验设计及数据的统计学处理；马鹏负责实验验收；王晋喜负责论文校对；郭修栋负责实验实施和数据统计
参考文献
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