溃疡性结肠炎中药组方规律及整合药理学分子机制探索

1  数据与方法

1.1  数据来源

1.1.2 

1.1.3  候选靶标来源  在TCMIP的信息设定界面，以DRUGBANK提供的“Ulcerative colitis”药物信息作为疾病或症状关键词进行检索，建立候选疾病靶标库。在中药靶标预测界面对所建立的化学成分库中的成分进行靶标预测，选取相似性分数大于0.9的成分预测靶标作为候选。TCMIP可采用二维结构进行相似性搜索，并采用Tanimoto系数定义的相似度计量方法，通过与FDA上市药物进行化学结构相似性比对。

1.2  数据库

1.3  方法

1.3.1  蛋白质-蛋白质相互作用信息（PPI）  中药方剂潜在靶标与溃疡性结肠炎疾病靶标之间的PPI可通过TCMIP直接获得，该平台镶嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase等数据库中PPI数据。

1.3.2  基因功能和通路富集分析  TCMIP整合基因本体数据库GO和KEGG通路数据库资源，可直接提取靶标基因或蛋白质的分子功能（molecularfunction）、细胞内定位（subcellular localization）及其所参与的生物学反应（biological process）和通路（pathway），并通过富集计算，针对中药方剂的直接作用靶标，进行基因功能分析和通路分析，并将P值排名靠前的通路展示在结果中^[6]。

1.3.3  靶标网络构建与分析  TCMIP通过网络分析模块，针对中药方剂的潜在靶标与疾病靶标之间的PPI信息计算网络特征值，以节点连接度（degree）的2倍中位数为卡值，选取中药靶标-疾病基因互作网络的核心节点（hubs）；在此基础上，以度（degree）、节点紧密度（closeness）和节点介度（node-betweenness）的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为中药方剂的潜在靶标与疾病靶标之间的相互作用的关键靶标网络^[5]。通过对其候选靶标所参与的通路进行富集分析，进一步挖掘中药方剂治疗溃疡性结肠炎的关键靶标、成分以及中药，并构建可视化的“中药方剂-中药材-化学成分-核心靶标-关键通路-疾病关键病理环节”多层次网络关联图，明确其作用机制^[7]。

1.4  数据分析

1.4.2  核心组合的分子机制研究  应用TCMIP靶标预测、网络构建等功能，进行分析及可视化工作。分别构建经典名方与筛选新方的成分-靶标网络，及中药方剂-溃疡性结肠炎相关靶标网络，并对经典名方与筛选新方所作用的溃疡性结肠炎相关靶标进行功能分析及通路分析对比。

1.4.3  经典名方确定  结合用药频次统计、组方规律分析的结果，参照《中药经典名方复方制剂简化注册审批管理规定》的简化注册审批的经典名方制剂符合条件：处方中不含配伍禁忌或药品标准中标识有“剧毒”“大毒”“有毒”及现代毒理学证明有毒性的药味，将所得到的药对组合在《中医方剂大辞典》记载的溃疡性结肠炎治疗方剂中进行全面筛选，确定包含核心药对的经典名方。

1.4.4  新方确定及效果验证  参照经典名方制剂的符合条件，排除新方筛选出的有毒中药，确定最合适的新方。将确定的经典名方和确定的新方进行整合药理学对比分析，基于文献提供的实验结果对获得的经典名方和新方进行效果验证。

2  结果与分析

2.1  用药频次统计

对《中医方剂大辞典》治疗溃疡性结肠炎的处方中的药物频次进行统计，其中使用频次高于20的有22味药，见表1。使用频次前10位的分别是甘草、黄连、木香、当归、陈皮、厚朴、干姜、白芍、槟榔、枳壳。

溃疡性结肠炎病位在肠，又因肺和大肠相表里，可用归于本经的药物，亦常配合应用归于相表里经脉的药物，以达到表里同治的目的。溃结病因病机

为“脾虚为本，湿热为标”，溃结便血患者需遵循急则治其标的止血原则，故应用药物归经也包括肝经。脾胃位于中焦，为后天之本，主运化水湿，归脾胃经可达温中健脾、运化水湿之功效。肾为先天之本，归肾经以温补脾肾。诸多医家认为脾虚是溃疡性结肠炎发病的基础，正如张景岳所说“泄泻之本，无不由于脾胃……脾胃受伤，则水反为湿，谷反为滞……而泻痢作矣”。故中药治疗溃疡性结肠炎所采用的补益类药物中，多以健脾益气为主^[8]。

甘草气平禀金气入肺，味甘禀土味益脾；黄连气寒味苦，归心、胃、肝、大肠经，泻心火，除脾胃中湿热，针对“湿热为标”的病机；木香味甘、苦，气温，归脾、胃、大肠、胆经，能调中宣滞、行气止痛；当归入肝、心、脾经，气温，味辛、甘，禀土之甘味益脾；白芍味酸寒，归肝脾经，制肝补脾，缓中去水，利膀胱大小肠；厚朴味苦、温，厚肠胃，温中益气，疗霍乱及腹痛。

以白芍、甘草为君，当归、白术为佐主治痢疾腹痛。木香与柴胡、枳壳等同用，治脾失运化，肝失疏泄，湿热郁蒸；木香与黄连同用，治湿热泻痢；木香与槟榔、青皮等同用治积滞内停，脘腹痞满胀痛、大便秘结者。木香能行气止痛，又能调中进食，与干姜陈皮同用可和胃。

2.2  组方规律分析

2.2.1  药对及药物组合的用药规则  结果见表2。按照药物组合出现频次由高到低排序，前5位分别是甘草-木香、黄连-木香、黄连-当归、甘草-当归、当归-木香。甘草-木香合用可缓解腹痛腹泻；黄连-木香合用既可清热燥湿，又能行气导滞；黄连-当归合用可清肝泻火、和血止痛；甘草-当归合用可缓解当归因行血走血故能滑肠，其气与胃气不相宜的弊端，可和中养胃培护脾土；当归-木香合用去滞止痛、消除虚寒。高频出现的药对具有缓解溃疡性结肠炎的临床症状的作用，对腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等均有明确的疗效。

2.2.2  经典名方挖掘  为保证中药方剂的精简高效和便于对比分析，经过对比《中医方剂大辞典》中治疗溃疡性结肠炎的中医方剂条目，寻找以包含核心药对在内的最少组成的方剂作为候选的经典名方，发现香连丸是唯一符合条件的由黄连-木香核心药对组成的经典名方。

自李绛创制香连丸这首治疗湿热泻痢的名方后，为后世木香广泛用于治疗泻痢开创了先河。后世在此方基础上多有发展，从而形成了众多香连丸同名方及剂型变异方，以香连丸为基础的加减化裁方更不胜枚举，使其更具有针对性和实用性，其配伍也具有一定的灵活性。从而证实香连丸具备成为经典名方的条件。龙群^[10]对香连丸对大鼠溃疡性结肠炎治疗作用进行了实验研究，与模型对照组比较，香连丸组的大鼠疾病活动指数（DAI）、结肠指数均有明显变化，差异显著（P＜0.05）；结肠炎症反应情况较轻微，大鼠结肠黏膜未见糜烂及溃疡形成，炎细胞浸润轻，黏膜血管轻度充血。通过以上文献提供的实验结果，证实了中医传承平台软件挖掘的经典名方香连丸在实验过程中表现的有效性，可以有效改善大鼠DAI和结肠指数等指标，减轻结肠炎症反应，与中医理论推演的结果基本一致。

2.3  新方分析

    进行药物间的关联度分析、基于无监督熵层次聚类、基于熵层次聚类获得治疗溃疡性结肠炎3个新处方。见表3。

利用本软件的“网络展示功能”可以采取网络可视化方式，直观地展示出药物不同组合之间的关系，得到治疗溃疡性结肠炎新处方的网络可视化展示。见图1。

参照经典名方制剂的符合条件，排除新方筛选出的有毒性的中药黄丹、砒霜、木鳖子、雄黄、山慈菇。确定合适的新方为木香、当归、黄连、槟榔、莱菔子、枳实组合。

新方中，木香健胃宽中，食可消而痢可止，刘海荣等^[11]采用木香对溃疡性结肠炎大鼠干预作用进行了实验研究。与模型对照组比较，木香组大鼠DAI和结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分、结肠组织病理学、血清超氧化物歧化酶（SOD）、血浆丙二醛（MDA）、血浆前列腺素E₂（PGE₂）和表皮细胞生长因子（EGF）、结肠肠三叶因子（TFF3）表达的影响均有显著性差异（P＜0.05）。当归气味辛温，温中止痛，茹庆国 ^[12]采用当归提取物对溃疡性结肠炎大鼠干预作用进行了实验研究。当归提取物对大鼠的大体损伤评分、病理切片分析均有显著性作用，对溃疡性结肠炎的发生发展均表现不同程度的延缓和改善作用（P＜0.05）。黄连主治肠澼腹痛、久下泄澼脓血，武涛等^[13]采用黄连水煎液对溃疡性结肠炎大鼠干预作用进行了实验研究。与模型组相比，黄连水煎液组对大鼠体质量增加、大鼠结肠异常腺窝病灶（ACF）的增加、结肠组织增生均有显著影响（P＜0.05）。槟榔味辛温，主消谷逐水，专破滞气下行，吕涛等^[14]采用槟榔颗粒溶液对大鼠离体结肠平滑肌进行了实验研究，槟榔对大鼠结肠平滑肌的收缩活动有兴奋作用，且呈正相剂量关系。莱菔子味辛性温，下气宽中，攻肠胃积滞。衣兰娟等^[15]采用莱菔子水煎液对豚鼠离体结肠平滑肌进行了实验研究，莱菔子水煎液对豚鼠结肠平滑肌的收缩活动有兴奋作用。枳实味苦酸，除寒热热结，止痢，谢冬萍等^[16]采用枳实水煎液对大鼠离体结肠平滑肌进行了实验研究，枳实水煎液对豚鼠结肠平滑肌自发收缩活动有抑制作用。

2.4  TCMIP分析

2.4.1  化学成分统计分析  新方中槟榔共收集化学成分34个，主要化学成分为槟榔碱类、多酚、脂肪油，还有甘露糖、皂苷等。当归共收集化学成分65个，主要化学成分为挥发油、有机酸、多糖和黄酮等；挥发油中藁本内酯的含量最高，其次为丁烯基酞内酯；有机酸类主要是阿魏酸。黄连共收集化学成分14个，主要化学成分为生物碱，包括小檗碱、黄连碱等，非碱成分有阿魏酸、绿原酸等。莱菔子共收集化学成分9个，主要化学成分为天然硫苷，此外还含有挥发油类、脂肪酸类、生物碱类、黄酮类、多糖和蛋白质类等。木香共收集化学成分64个，主要化学成分为倍半萜、三萜、木脂素等。枳实共收集化学成分49个，主要化学成分为黄酮类、生物碱类、挥发油类等。

根据条件筛选出香连丸关键靶标237个，其中化学成分直接作用节点82个，疾病靶点5个，分别是B细胞编码κ轻链多肽基因抑制激酶B（IκBKB）、硫嘌呤甲基转移酶（TPMT）、黑皮质素-2受体（MC2R）、γ干扰素（IFN-γ）、髓过氧化物酶（MPO）。新方组合关键靶标298个，其中化学成分直接作用节点103个，疾病靶点4个，分别为脂蛋白脂酶（LPL）、趋化因子受体9（CCR9）、IFN-γ和TPMT。两者共有的疾病靶点为IFN-γ和TPMT。

Eckmann等^[17]采用肠上皮细胞中缺乏IκBKB的小鼠模型进行验证实验，表明肠上皮细胞中缺乏IκBKB的小鼠的溃疡性结肠炎的症状更为严重，IκBKB在溃疡性结肠炎初始损伤过程中发挥全面保护作用。Kosaka等^[18]采用对照溃疡性结肠炎患者和健康对照人群获得的血样提取DNA，测定LPL基因多态性，发现LPL多态性可能是影响溃疡性结^[20]选择溃疡性结肠炎患者和正常对照者，并测定两者粪便中钙卫蛋白（Cal）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、MPO的水平，证实了粪便中Cal、MMP-9、MPO水平可作为溃疡性结肠炎患者疾病活动性评估的指标。钟万锷等^[21]用免疫组织化学法检测活动期溃疡性结肠炎及正常对照石蜡包埋组织中趋化因子（C-C基序）配体25（CCL25）及CCR9的表达情况，表明CCL25/CCR9相互作用参与了溃疡性结肠炎的发生和发展，其高低反映了疾病的炎症程度，可作为药物治疗的潜在靶点。

综上所述，可以了解经典名方香连丸通过IκBKB、TPMT、IFNG、MPO靶点，新方通过LPL、CCR9、TPMT靶点对溃疡性结肠炎的干预存在关联作用。

2.4.3  功能富集分析、通路富集分析  运用平台的网络构建与分析功能进行香连丸和新方Hub节点及其通路、功能富集分析、通路富集分析并进行对比。结果见表4、5。

药物靶标与疾病靶标基因功能及KEGG通路富集分析显示，香连丸与新方在GO基因功能相同的方面包括线粒体、线粒体基质、血红素结合、柠檬酸循环（TCA循环）、琥珀酰辅酶A的代谢过程、磷脂酸的生物合成过程等。香连丸与新方在主要作用通路相同的方面有碳代谢通路、血管内皮生长因子信号转导通路、TCA循环通路、促性腺激素释放激素的信号转导通路、脂质代谢通路、甘油磷脂代谢通路等。

2.4.4  中药-成分-关键药靶-通路网络可视化分析  运用平台的关键靶标分析功能分别进行香连丸与新方核心靶标网络可视化分析、关键靶标功能富集分析、关键靶标的通路富集分析、中药-成分-关键药靶-通路网络可视化分析。结果见图4、5。

结合网络关键靶标功能富集分析、关键靶标的通路富集分析、中药-成分-关键药靶-通路网络可视化分析的结果，对比图4和5，可以发现香连丸和新方化学成分对于溃疡性结肠炎的干预主要集中在细胞代谢、能量代谢相关通路的靶标上。查阅相关文献发现，目前对于溃疡性结肠炎的干预机制研究多集中于炎症方面^[22]，有关能量代谢方面的研究较少^[23]。新方干预溃疡性结肠炎通过能量代谢通路还需要一定的实验进行验证。

3  讨论

本研究通过中医传承辅助平台，挖掘并分析了经典名方香连丸以及新方，通过文献提供的实验证实了经典名方具有确切的有效性，并且依据文献实验资料揭示了新方的中药组成的作用。经过分子机制关联进行深入分析，对药理学整合平台挖掘发现的靶点均获得了文献支持的依据证明，同时通过核心成分-关键靶标-主要通路多维网络关系图发现存在与能量代谢通路的关联性。这为下一步的深入研究提供了方向性的启示。香连丸以及挖掘的新方在溃疡性结肠炎方面与能量代谢通路相关，目前这方面的文献报道还不充分，之后可以从能量代谢方面对香连丸以及挖掘的新方的机制进行深入研究。

参考文献（略） 

来  源：赵振营，李亚卓，于  飞，张  昭，廖茂梁，张惠娟，刘昌孝. 溃疡性结肠炎中药组方规律及整合药理学分子机制探索 [J]. 中草药, 2018, 49(13):3042-3050.