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这次分享一篇由天津医科大学肿瘤医院的巴一教授研究团队在Oncogene杂志上在线发表的题为“Exosome circRNA secreted from adipocytes promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targeting deubiquitination-related USP7”的研究，发现脂肪细胞分泌含有circ-DB的外泌体调控肝细胞癌HCC的去泛素化，促进细胞的增殖。临床上也发现体脂率高的HCC患者血浆外泌体中的circ-DB表达水平上调。机制上，外泌体circ-DB被肝癌细胞摄取后，抑制miR-34a表达水平，活化去泛素化相关的USP7/Cyclin A2信号通路，从而促进HCC的增殖和减少细胞DNA损伤。
1. HCC患者中exo-circ-DB和 USP7表达情况 分离HCC患者和正常人血浆外泌体后，进行电镜表型鉴定、WB鉴定特征性蛋白表达、颗粒直径分析。根据HCC患者的体脂率高低分为两组，对两组患者血浆中外泌体circRNAs表达分析，筛选出体脂率高的患者血浆外泌体circ-DB (circ-deubiquitination)的表达水平出现3倍左右的上调。Has_circ_0025129来源于12号染色体的TNFRSF1A（TNFR1）基因。 据报道，USP7介导的NFkappaB的去泛素化对TLR和TNFR诱导的基因表达是必需的，因此USP7可能在调节TNFR1信号通路和circ-DB的形成中起到正反馈的作用。临床上，体脂率高的HCC患者组织中的USP7表达水平明显上调，外泌体circ-DB与HCC组织中USP7表达成正比；将生物信息学分析，circ-DB和miR-34a可能存在相互结合，而USP7 mRNA上存在miR-34a结合位点，因此作者提出假设，脂肪细胞分泌含有circ-DB的外泌体被HCC摄取后，海绵并降低miR-34a表达，上调USP7的表达。 2. exo-circ-DB, miR-34a和USP7三者的临床相关性 IHC结果显示体脂率高的HCC患者的癌旁组织和肿瘤组织中USP7的表达都出现明显上调；USP7表达水平高的患者的存活率相对较低；相对体脂率偏高的患者，体脂率偏高的患者血浆外泌体中的circ-DB表达水平出现明显上调；而体脂率偏高的患者的HCC组织中的miR-34的表达水平明显降低，但是两组的USP7 mRNA水平无明显差异（提示可能影响其翻译后修饰）；HCC组织中miR-34a的表达水平与exo-circ-DB和USP7的表达水平成负相关。 3. miR-34a与USP7之间是否存在相互作用？ 经生物信息学预测，miR-34最有可能结合USP7的3′-UTR区域，miR-34a mimics上调miR-34a表达，而miR-34a 抑制剂可以抑制miR-34a表达；IP-qPCR实验证明miR-34a可以捕获和富集USP7 mRNA；荧光素酶报告基因实验进一步证明miR-34a可以结合USP7启动子，并调控其表达；WB实验证明上调miR-34a表达可以抑制USP7和Cyclin A2的表达，而抑制miR-34a表达可以促进USP7和Cyclin A2的表达；由于miRNAs一般会在翻译后水平负调控基因的表达，而USP7抑制Cyclin A2的泛素化降解，而不影响其mRNA水平。所以RT-qPCR结果显示miR-34a mimics和inhibitors没有影响到USP7和Cyclin A2的mRNA表达水平。而过表达或者敲低USP7的表达可以明显上调或者下调Cyclin A2的表达水平，提示miR-34直接抑制USP7表达，而USP7直接调控Cyclin A2的表达。 4. 脂肪细胞来源的外泌体到底对HCC细胞有什么效应？ 对3T3L1细胞来源的外泌体进行表型鉴定，发现相比于脂肪前体细胞或者其来源的外泌体，成熟脂肪细胞或者其来源的外泌体中的circ-DB表达水平明显上调；circ-DB表达敲低的3T3L1细胞来源的外泌体被称为3T3L1 exo circ-DB del；3T3L1 exo处理HCC细胞可以明显抑制miR-34的表达，上调USP7和Cyclin A2的表达水平，而3T3L1 exo circ-DB del处理HCC细胞可以明显上调miR-34的表达水平，下调USP7和Cyclin A2的表达水平，提示携带exo-circ-DB的外泌体可以直接影响USP7 和cyclin A2的表达。 5. circ-DB 和miR-34a之间存在什么联系？ 生物信息学分析预测，circ-DB 和miR-34a之间存在两个结合位点；luciferase reporter实验证实了circ-DB 和miR-34a的相互结合；敲低circ-DB表达明显促进miR-34a表达，而抑制USP7 和cyclin A2的蛋白表达水平；circ-DB过表达明显抑制miR-34a表达，而促进USP7 和cyclin A2的蛋白表达水平，提示circ-DB可能作为miR-34a的sponge，发挥相应的功能。 6. 脂肪细胞来源的外泌体对HCC细胞的生长有什么影响？ 3T3L1 exo处理HCC细胞可以明显促进其增殖（Edu实验）和迁移（transwell实验），减少其DNA损伤（H2AFX染色）；而3T3L1 exo circ-DB del处理HCC细胞后的效应则无明显的相应促进和降低效应。IF实验进一步证明，在HepG2细胞中分别过表达或者敲低circ-DB/USP7，相应地明显促进其增殖能力，减少DNA损伤情况，提示脂肪细胞来源的外泌体通过传递circ-DB到HCC细胞中，促进HCC细胞的增殖和减少其DNA损伤。 7. USP7介导下游靶点cyclin A2的去泛素化 IP实验证明，3T3L1 exo 处理HCC细胞，可以明显降低Cyclin A2 的泛素化，而3T3L1 exo circ-DB del处理对Cyclin A2 的去泛素化水平降低；分别过表达USP7或者 circ-DB，或者抑制miR-34a表达，可以明显降低Cyclin A2 的泛素化；而敲低USP7或者 circ-DB的表达，或者过表达miR-34a，则明显增强Cyclin A2 的泛素化，提示USP7作为一个致癌基因，可能通过抑制下游蛋白（包括cyclin A2）泛素化，维持相关基因的蛋白水平，促进肿瘤的发生发展。 8. 体内实验验证circ-DB对于肿瘤生长的作用 构建circ-DB过表达和敲低的Hepa1-6细胞移植到小鼠体内，C57属于体脂率正常的小鼠，而ob/ob小鼠属于体脂率偏高的小鼠；ob/ob小鼠血清外泌体中的circ-DB表达水平明显上调，C57小鼠中的circ-DB过表达组小鼠血清外泌体和肿瘤组织的circ-DB表达水平明显上调，肿瘤体积相对偏大，促进肿瘤发生肝转移；ob/ob小鼠中的Hepa1-6组的circ-DB表达水平明显上调，促进肿瘤发生肝转移，而circ-DB敲低组只有在肿瘤组织的circ-DB表达水平明显下调，肿瘤体积相对偏小，抑制肿瘤发生肝转移，提示体脂率偏高的小鼠血清外泌体可以传递更多的circ-DB到HCC细胞中，促进肿瘤生长和转移。 9. 体内实验证明circ-DB/miR-34a/USP7通路对于HCC的作用 在Hepa1-6细胞的体内成瘤实验的基础上，分析C57小鼠中circ-DB OE组和ob/ob小鼠中Hepa1-6组的肿瘤组织中miR-34a的表达水平明显降低，USP7和Cyclin A2蛋白表达水平明显升高；而ob/ob小鼠中circ-DB KD组的肿瘤组织中miR-34a的表达水平明显升高，USP7和Cyclin A2蛋白表达水平明显降低，提示了脂肪细胞来源外泌体circ-DB介导的miR-34a/USP7/Cyclin A2通路，可以促进HCC的小鼠体内生长和转移。
小结: 肝细胞癌是一种常见的肝疾病，其诱因包括慢性HBV/HCV感染、喝酒过多、免疫相关肝炎、肥胖。而肥胖是导致非酒精性肝炎的重要原因，作者在研究肥胖影响肝癌发生发展的机制过程中，结合了血浆外泌体、circRNA、miRNA等研究热点，是本文的一个亮点。本文的思路是很清晰和简单的，在体脂率高的HCC患者血浆外泌体中筛选到表达上调的circ-DB，结合已有的研究报道和生物信息学预测分析，发现circ-DB可以海绵结合miR-34a，上调其下游靶基因USP7的表达，导致USP7诱导下游癌基因相关的靶蛋白的去泛素化增强，上调其中一个重要癌蛋白cyclin A2的表达，减轻HCC的DNA损伤，促进HCC的增殖和迁移，容易导致HCC的肝转移发生。
参考文献 1. Zhang H, et al. Exosome circRNA secreted from adipocytes promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targeting deubiquitination-related USP7. Oncogene. 2018 Dec 13. doi: 10.1038/s41388-018-0619-z. |
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